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玉米转录因子ZmMADS47和籽粒转录因子Opaque2互作可协同调...

2020.5.25

玉米转录因子ZmMADS47和籽粒转录因子Opaque2互作可协同调控醇溶蛋白的表达

玉米（Zea mays）原产于墨西哥和中美洲地区，是一种由古印第安人（Indians）在数千年前利用野生墨西哥类蜀黍（Euchlaenamexicana）（现存在于墨西哥和尼加拉瓜）杂交而来的品种。但是，作为一类重要的粮食作物，天然玉米籽粒在其营养价值上却有着重要的缺陷。根据已有的文献报道，玉米籽粒中，含量最大的储藏性蛋白——醇溶蛋白中，赖氨酸和色氨酸这两种人类必需的氨基酸含量严重缺乏，导致玉米籽粒整体营养价值不佳。因此，如何能够提高玉米籽粒的营养价值就成为现代社会人类需要解决的一个重要课题。

有报道，玉米籽粒特异的bZIP类转录因子Opaque2(O2)在籽粒发育过程中起到关键作用。Opaque2(o2)突变体相对于野生型籽粒而言表现出了显著的粉质胚乳的表型。有研究表明，O2基因可以结合22-kD α-zein醇溶蛋白启动子的O2 motif（TCCACGTAGA）从而调控该基因家族的表达。除此之外，19-kD α-zein、14-kD β-zein、27-kD γ-zein和50-kD γ-zein同样都是O2基因的调控对象，其最保守的结合结构域为TGACGTGG。O2基因在玉米籽粒营养代谢中的价值巨大，与其有关的方方面面都被人们关注。但是，其转录后调控的研究却始终没有较全面的进展，以至于始终没有深入的挖掘其生物学功能。

上海大学的研究人员通过对Opaque2的酵母双杂交（Yeast two-hybrid screening）技术对其互作蛋白进行筛选以及功能分析，从而对Opaque2调控下游基因的表达的理论模型做出了进一步的解释和完善。该研究成果已经被国际著名学术期刊杂志PLOS Genetics接收，即将在线发表。该研究是上海大学通信学院的博士研究生乔祯逸在宋任涛教授和生命学院青年教师祁巍巍博士的指导下完成的。该研究中RNA-Seq服务由上海伯豪生物技术有限公司提供。

研究思路

研究结果

1.研究人员利用酵母双杂交技术对O2蛋白的互作蛋白进行筛选，以期望能够拓展O2在籽粒发育时期起到的作用机制。在酵母双杂交实验中，研究人员筛选到一个属于MADS类转录因子家族的蛋白ZmMADS47，并且该蛋白与O2之间的互作通过GST Pull-down、coIP以及凝胶过滤实验的验证（图1）。

2.ZmMADS47与O2的表达谱分析
研究人员对ZmMADS47的全长蛋白以及分段蛋白进行了转录激活能力的检测。结果发现， ZmMADS47的C端不保守结构域则表现出了极强的转录激活能力（图2）。该结果中，ZmMADS47全长则仅仅表现出了较弱的转录激活能力。这可能是由于ZmMADS47的C端转录激活结构域被全长包裹其中使得其转录激活能力的不到释放，而在酵母体系中又缺乏一些能够使其转录激活能力得以释放的因子，从而导致ZmMADS47全长在酵母中相对于玉米籽粒天然状态中的构型与修饰存在差异，从而影响了全长的转录激活能力。

3.ZmMADS47 RNAi株系的转录组表达谱分析

为了对ZmMADS47 RNAi后整体基因表达水平进行一个大致的了解，研究人员使用了上海伯豪的玉米mRNA高通量测序服务对ZmMADS47 RNAi籽粒的模式进行转录组层面的研究。GO归类后发现，差异基因主要被归类于营养储藏类（表一）。

4.ZmMADS47 RNAi籽粒的表型观察

qPCR、SDS-PAGE、Western-blot对醇溶蛋白RNA和蛋白水平的研究发现，α-zein和50-kD γ-zein的积累量都出现了一定程度的下降。但与o2突变体的opaque表型不同的是，ZmAMDS47 RNAi籽粒中并没有出现明显的opaque表型（图3）。

5.蛋白体大小与形状在ZmMADS47 RNAi籽粒中发生变化

研究人员对ZmMADS47 RNAi籽粒进行了透射电镜的观察，结果表明，突变体的蛋白体大小分配上出现变化，并且部分蛋白体出现畸形（图4）。

6.ZmMADS47可以结合醇溶蛋白启动子

研究人员对ZmMADS47和醇溶蛋白启动子的体外结合研究发现，ZmMADS47可以结合α-zein和50-kD γ-zein的CATGT启动子，并且和O2一同调控醇溶蛋白的表达（图5）。

7.ZmMADS47促进O2调控醇溶蛋白表达

ZmMADS47与O2瞬时转化洋葱表皮细胞后发现，ZmMADS47本身单独不能激活下游靶标，而与O2一同转化后，则可以不同程度的增加下游靶标的转录激活能力（图6）。

8.O2释放ZmMADS47的转录激活能力

研究人员通过对ZmMADS47，O2以及50-kD醇溶蛋白的突变研究表明，O2可以通过和ZmMADS47的蛋白互作释放ZmMADS47 C端的转录激活能力，从而促进下游醇溶蛋白的表达（图7）。

讨论
本研究中，研究人员通过对Opaque2蛋白的酵母双杂交筛库筛选到了一个MIKC亚类的MADS类转录因子ZmMADS47。对ZmMADS47进行RNAi后的转录组研究发现，ZmMADS47同样对醇溶蛋白存在着调控关系。体外DNA－蛋白互作（EMSA）实验证实ZmMADS47对α醇溶蛋白以及50-kD γ-zein有着直接结合。ZmMADS47与Opaque2的瞬时转录激活测试表明，Opaque2可以释放ZmMADS47的转录激活能力，从而一同增强对α醇溶蛋白以及50-kD γ醇溶蛋白的调控。该研究成果不仅大大拓展了人们对玉米籽粒醇溶蛋白调控机制的认识，还对植物MIKC亚类MADS类转录因子在植物发育过程中的生物学功能有了进一步的延伸。

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周锦帆