杆状病毒储液制备实验——噬斑试验测定滴度
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| 实验步骤 | 1. 用含 10％ 胎牛血清的 TNM-FH 培养液稀释处于对数生长期的 Sf 9 细胞至约 5 × 105 细胞/ml。在噬斑试验之前几小时，以两种不同的密度（2 × 106 和 1.5 × 106 细胞/ml）将细胞种于 60 mm 组织培养皿中。对病毒储液的每一稀释度均设复皿（二个组织培养皿），27℃ 培养。 2. 根据病毒储液的来源，用 TNM-FH /10％ FBS 培养液制成 5 ml 病毒储液的系列稀释液。 高滴度病毒储液：10-6、10-7、10-8 稀释 转染上清（野生型病毒环状 DNA）：10-4、10-5 和 10-6 稀释 转染上清（野生型病毒线性化 DNA）:10-1 和 10-2 稀释 单个噬斑：10-1、10-2 和 10-3 稀释 3. 用一根灭菌巴斯德吸管小心从细胞（步骤 1）中吸去培养液。每一稀释度的病毒均加 1 ml 至各复皿中 27℃ 温育 1 h， 加入病毒时摇动培养皿以保证病毒能均匀感染细胞。 4. 温育 1 h 后，制备琼脂糖顶层覆盖物。 5. 用一根灭菌巴斯德吸管吸去病毒上清液，加入 4 ml 琼脂糖覆盖物。让琼脂糖室温固化 10～20 min (让凝结的水滴散去）。用 Parafilm 膜分别封住每个平皿（以防干涸），27℃ 培养 6～8 天。 6. 在噬斑形成较好而且裸眼容易看出的培养皿上，计数每一稀释度形成的噬斑数，计算病毒滴度（pfu/ml）。在 10-7 稀释度的培养皿形成 10 个噬斑或在 10-8稀释度的培养皿形成 1 个噬斑，病毒滴度计算为 108 pfu/ml。 7. 如果裸眼辨别噬斑时遇到困难，则用台盼蓝染色。制备台盼蓝覆盖物，倾覆 1 ml 至培养了 6～8 天噬斑形成较好的培养皿中。27℃ 过夜温育培养皿，让染料扩散进入死细胞，计数蓝色噬斑的数目并确定病毒滴度。（噬斑内的死细胞将吸收台盼蓝染料，噬斑周围的活细胞不会吸收台盼蓝染料。） 确定病毒滴度的另一方案是终点稀释法。采用这种方法，需制备一系列病毒稀释液，并以此感染微量滴定板中的细胞，然后记好每一孔是否存在病毒感染并确定 50％ 终点。然而用这种方法滴定重组病毒储液，得到的结果与噬斑试验相比较难解释。野生型病毒由于包含体的聚集很容易计数，而重组病毒则由于没有包含体有时难以计数。 收起 |
| 注意事项 | 1. 每一稀释度均设复皿是必需的，因为噬斑实验的结果有差异。通常测定 3 个不同稀释浓度的病毒所形成噬斑，共需要 12 块组织培养皿测定每种病毒储液的浓度（6 块培养皿以 1.5 × 106 细胞/ml 接种，6 块培养皿以 2 × 106 细胞/ml 接种）。 2. 做病毒噬斑试验时，细胞单层培养物的密度很关键。如果培养 5 天后，噬斑仍然太小，则细胞接种太密；如果噬斑太大和扩散，则细胞接种太稀。对特定细胞系，可用一系列不同的细胞密度通过噬斑实验确定其最佳噬斑细胞密度。 3. 如果重组病毒含有 lacZ 基因，如来自 pBlueBacIII (Invitrogen) 或 pAC360 β-Gal 的重组体，在琼脂糖固化前加入 150 μg/ml X-gal（来自 20 mg/ml 储存液，储存液由无菌的二甲基甲酰胺制备， -20℃ 可保存数月），重组体的噬斑因显示明亮的蓝色容易与非重组体辨别。 4. 步骤 5 中，若使用加湿的 27℃ 培养箱，培养皿无需用 Parafilm 膜封住。 5. 噬斑持续形成至 2 周。如果在 2 周时还看不到噬斑，可能由于细胞接种密度过高所致，应该以较低密度（在 1 × 105 和 1.3 × 106 细胞/平皿之间）重新接种。 |
