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噬菌体铺平板产生噬斑实验——连续稀释法

2019.3.25

实验方法原理	这种方法能从单个噬斑中分离出纯的噬菌体部落，而且可以对噬菌体母液进行浓度测定。
实验材料	大肠杆菌
试剂、试剂盒	麦芽糖培养基
仪器、耗材	平板微波炉试管加热器毛细管
实验步骤	1. 在含0.2 %麦芽糖和10 mmol/L MgSO₄的λ肉汤培养基培养大肠杆菌至饱和。加0.3 ml的大肠杆菌培养液到5个8 mmX80 mm的试管里。在把加有顶层琼脂培养基的瓶子放到微波炉前一定要松开瓶盖！ 2. 在微波炉解冻状态下溶化顶层琼脂培养基，或煮沸水浴15 min。室温下冷却瓶子5 min，然后将加有溶化琼脂培养基的瓶子放于45~50°C水浴。 3. 用SM将噬菌体溶菌液进行连续稀释（如100倍的稀释)。加第一个稀释液0.1 ml到一只大肠杆菌试管里，再加第二个稀释液的0.1 ml到另一只试管里，其他依次稀释。标记好大肠杆菌/噬菌体混合物的试管，以便它们彼此不混淆。将试管放于室温培养20 min。 4. 将试管移到37 °C水浴或加热器10 min。从水浴取出试管。 5. 往每一只试管加2.5 ml的顶层琼脂培养基，轻轻晃动使其混合，将试管内容物倒到平板上。轻柔地倾斜平板使琼脂糖培养基平铺到整个平板表面。将平板放于37°C恒温箱培养6~12 h。 6. 从一个噬斑不太密集的稀释平板上用无菌毛细管或牙签挑选单个噬斑。为了以备噬斑将来使用，用毛细管切下一块含有噬斑的琼脂并把它弹到含1 ml的SM的试管里（或把牙签尖放到液体里轻轻搅动）。如果需要，计数一个稀释平板上的噬斑并估计在最初的库里感染性噬菌体数。收起
注意事项	1. 所有与大肠杆菌接触的材料都应是无菌的。 2. 在把加有顶层琼脂培养基的瓶子放到微波炉前一定要松开瓶盖！ 3. 最好制备同时符合以下两个条件的对照平板：没被感染的大肠杆菌的菌苔和不含细胞的顶层琼脂培养基。