实验步骤 |
―、材料与设备
1) 无核酸酶污染的水。
2)[35S] 标记的甲硫氧酸.:1X105mol/L,lOOOCi/mmol
3) 质粒 DNA 模板
4)TNT 快速超级混合液:主要包括 TNT-兔网织红细胞裂解物,TNT 反应缓冲液,TNTRNA 聚合酶,核苷二磷酸混合液,l0 mmol/L 精胺和 RNasin(30〜60U)。
5)T7TNTPCR 增强液
6) 一 70°C 冰箱
7) 冰浴
8) 微量移液器
9) 离心机
10) 水浴槽
11) 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置
二、操作方法
(-)以质粒 DNA 为模板进行体外转录/翻译
1) 将 TNT 快速超级混合液从一 70℃ 冰箱中取出后,手握反应管以使其尽快融化。当 TNT 快速超级混合液融化后,将其置于冰上其他组分可在室温屮融化,然后置于冰上。
2) 参照表 4.4 中的反应体系,于 0.5 ml 或 1.5 ml 的离心管中加入反应混合物,在加入所有的组分之耵,用移液枪轻轻上下吹打混匀。如有必要,可将离心管进行短时的离心以使反应混合物聚集到管的底端。
3) 应设立一个不加入 DNA 的空白对照反应, 此对照反应可用于测量含有放射性标记的氨基酸的反应的背景,
4) 将反应管置于 30℃ 孵育 60〜90 min
5) 分析翻译结果。通过对产物中的放射性标记的氨基酸利用闪烁计数仪进行测定及对翻译产物的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析,从而鉴定翻译结果。
(二)以 PCR 产物为模板进行体外转录/翻译
具体操作步骤 H 八-) 以质粒为模板进行体外转录/翻译」中的 1)〜5)。 反应
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