液相色谱耦联Q Exactive 台式轨道阱质谱仪分析利...（一）
液相色谱耦联Q Exactive 台式轨道阱质谱仪分析利妥昔单克隆抗体
关键词
单克隆抗体，完整蛋白质的质量测定，序列确定，蛋白质去卷积，自上而下的测序
目的
优化液相色谱质谱工作流程，采用整体柱在线耦联Thermo Scientific Q Exactive 台式轨道阱质谱仪对单克隆抗体进行分析和表征。
前言
单克隆抗体（mAb）是增长需求最快的医药产品之一。他们在多种病症如癌症、感染性疾病、过敏症、炎症和自免疫疾病的治疗中发挥着主要作用。由于单克隆抗体可以表现出显著的异质性，作为治疗产品，新的mAb 要获得批准需要进行大量的分析表征。质谱法已经成为表征单克隆抗体的重要工具，能测定完整蛋白及分离的轻链和重链的分子量、解析糖基化和糖链的结构，确证正确的氨基酸序列，鉴定杂质，如生产过程中固有的宿主细胞蛋白质（HCP）。
利妥昔单抗是一个拮抗蛋白质 CD20 的重组单克隆抗体，其在美国的商品名为 RituxanR（Biogen Idec 公司/ 基因泰克公司），在欧洲的商品名为 MabTheraR（罗氏）。它是第一代肿瘤免疫治疗药物之一。利妥昔单抗分别在1997 年被美国食品和药物监督管理局和1998 年由欧盟委员会批准用于恶性淋巴瘤的治疗。这个抗体的可变区域作用靶点为细胞表面分子 CD20，这些分子存在于一些非霍奇金淋巴瘤中。
在这个应用报告中，结合使用自上而下和自下而上的方法，不管是分析完整和还原的利妥昔单抗，还是对其进行氨基酸序列分析，Q Exactive Orbitrap 质谱仪都具有优异的表现。
此外，评价了两套整体柱色谱系统在线耦合质谱仪的灵敏度。数据表明Q Exactive 系统具有优异的分辨率和质量准确度，是一个具有高置信度的筛选工具，可快速精确地进行生物制药产品的开发和表征。
实验部分
样品制备
本研究所有实验均采用商品化的单克隆抗体利妥昔。利妥昔是一种无菌，透明，无色，不含防腐剂的静脉滴注用浓缩液。该产品浓度为 10 mg/mL，通常配制成7.35 mg/mL 的柠檬酸钠缓冲注射液，其中含 0.7 mg/mL聚山梨醇酯 80、9.0 mg/mL 氯化钠和无菌水，采用氢氧化钠或盐酸水溶液调 pH 值至 6.5。
由于利妥昔单抗中含聚山梨醇酯80，在进行 LC / MS 分析之前需对样品进行透析。采用截留分子量为 3.5 kDa（MWCO）的Thermo ScientificTM Slide-A-LyzerTM 透析盒透析。在 4℃ 条件下，1 mL 利妥昔单抗在 2 L 20％ 乙腈水溶液中透析 48 h。
对利妥昔单抗的轻链和重链进行分析时，样品与 5 mM 三羧甲基磷酸（TCEP）在 60℃ 条件下孵育 30 min，还原样品中的二硫键。
为了对酶切后的 mAb 进行自下而上的分析，样品还原后，继续在室温暗处与 20 mM 碘乙酰胺（IAA）进行烷基化反应 30 min。样品采用 Thermo ScientificTM PierceTM C18 枪头进行纯化，采用 Thermo ScientificTM SpeedVaccTM 旋转浓缩仪进行干燥，然后溶解在 0.5 M 三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB ）中。在 0 h 和 1.5 h 先后两次，按照 1:15（w/w）的比例加入测序级修饰胰蛋白酶（Promega），在 37 ℃ 条件下酶切 2.5 h。最后，加入适量三氟乙酸（TFA），调 pH 值至约为 3。
所有样品放在含玻璃内插管的自动进样器小瓶中（0.1 ml微量内插管，透明玻璃，VWR）。
液相色谱
实验使用的色谱柱为按照文献制备的 160×0.20 mm 内径聚（苯乙烯- 二乙烯基苯）（PS-DVB）共聚物毛细管柱【1】和 Thermo ScientificTM PepSwiftTM 250×0.20 mm 内径的 PS-DVB毛细管柱。蛋白质的分离使用 Thermo ScientificTM DionexTM UltiMateTM 3000 RSLCnano 系统，该系统配置 3 nL z- 型微量检测池。分离过程中，柱温：55℃，流速：1 μL/min，色谱梯度：乙腈（ACN）溶液（含 0.05% 三氟乙酸 TFA）的浓度从 20%升高至 60%，运行时间：10 min。对于胰蛋白酶的酶切混合物，色谱梯度：B 相浓度从 0% 升高至 50%，运行时间：30 min。对于还原型抗体，色谱梯度：B 相浓度从 35% 升高至 45%，运行时间：15 min。
采用 Thermo ScientificTM ProSwiftTM RP-10R 50 mm×1.0 mm 内径的整体柱在更高流速分离蛋白质，使用的仪器为 Thermo ScientificTM DionexTM UltiMateTM 3000 RSLCnano 系统，该系统配置 45 nL 检测池。分离过程中，柱温设置为 55℃，流速为60 μL/min。色谱梯度：B 相浓度从 26% 升高至 80%，运行时间：20 min。对于还原型抗体，分离轻链和重链的色谱梯度：B 相浓度从 26% 升高至 56%，运行时间：20 min。
在上述梯度条件下，PepSwift 250 mm×0.2 mm 内径的整体柱压力在 190 bar 到 260 bar 之间，ProSwift RP-10R 50 mm×1 mm内径的整体柱压力在 120 bar 到 180 bar 之间。
在本研究的所有实验中，流动相 A 是 0.05% 三氟乙酸水溶液，流动相 B 是 0.05% 三氟乙酸的乙腈溶液。色谱梯度见表 1 和表 2。
表 1. 本实验所用的液相色谱梯度，
色谱柱： PepSwift 250 mm×0.2 mm 内径，流速：1 μL/min
表2. 本实验所用的液相色谱梯度，
色谱柱：ProSwift RP-10R 50 mm×1 mm 内径，流速：60 μL/min
质谱
本研究所有实验均采用 Q Exactive 台式静电场轨道阱质谱仪。采用 ProSwift RP-10R 50 mm x 1 mm 内径色谱柱进行实验时配合使用Thermo ScientificTM IonMaxTM 加热电喷雾离子源，喷雾电压为 4 KV，鞘气和辅助气流速分别为 15 和 5个单位。
