隐球菌病分子生物学研究进展
一、核酸提取技术的改进
进行分子生物学研究的前提是取得高数量和高质量的核酸，即DNA和RNA。由于隐球菌细胞壁外有一层厚厚的荚膜，为破除真菌细胞壁造成很大困难。可靠地提取隐球菌DNA的方法建立于20世纪80年代后期，研究者先后建立了玻璃珠方法、超声粉碎、液氮冷冻研磨等破壁技术。后来，发展酶学方法取代物理方法，用生物酶消化荚膜和细胞壁、制备原生质体，然后再用去污剂溶解细胞膜、释放DNA。目前常用的酶为Novozyme234，具有1，3-a-及1，3-b-萄聚糖酶、几丁质酶、蛋白酶、地衣酶、木聚糖酶等多种活性，破壁效果好。另外新生隐球菌能够产生细胞外DNA酶，在反应体系中始终保持高浓度的EDTA，可以有效地抑制DNA酶，防止DNA被降解。
二、基因克隆
已掌握的新生隐球菌的遗传图谱相当少，而且也相当不精确。目前还没有完成新生隐球菌全基因组的序列测定，只确定和报道了少数基因在染色体上的定位。
1、毒性基因
新生隐球菌的主要致病因素有四个：多糖荚膜、产黒色素、a接合型和37℃能存活。Still和Chang等应用经典的遗传学方法和基因互补技术分离，并鉴定了参于荚膜形成的基因----CAP59, 该基因编码458个氨基酸，含有6个内含子，经杂交分析确定CAP59基因定位于新生隐球菌的染色体Ⅰ上。二个克隆的荚膜形成必需基因----CAP64，其DNA全长1.9kb，预计编码522个氨基酸，有8个内含子，定位于染色体Ⅲ上。新生隐球菌的产黒素基因----CNLAC1也已克隆，该基因编码642个氨基酸，含14个内含子。a-接合型和a-接合型是一对等位基因，与新生隐球菌的性生殖有关，遗传公析显示a-接合型和菌株毒性增加存在关联，Moore等应用差异克隆技术获得了a-接合型相关基因----MFa,内含一个零拥有114bp的开放阅读框架（ORF)。
2、结构基因
Edman等应用大肠杆菌互补技术克隆了编码新生隐球菌乳清酸核苷-单磷酸-焦磷酸化酶（OMPase）的基因----URA5，该基因包括675个核苷酸和2个内含子，定位于1500kb左右的染色体上。Varma等经动物实验证实URA5阴性突变株其毒性明显降低，可见URA5基因与新生隐球菌的致病能力有关。Edman等随后克隆了编码新生隐球菌磷酸核糖胺咪唑羧化酶的基因----ADE2，磷酸核糖胺咪唑羧化酶参于嘌呤的生物合成，而在许多微生物中嘌呤代谢和菌株致病性间存在强烈的关联。ADE2基因有望成为探索抗真菌治疗的一个突破口。胸苷酸合成酶催化还原性甲基化反应，在DNA生物合成中起关键作用。Livi等应用PCR技术克隆了编码新生隐球菌胸苷酸合成酶的基因----CnTS，并测到了基因序列，克隆的CnTS基因长1127kp，有3个内含子和1个951bp的ORF,编码一分子量为35844Da的蛋白质。rRNA是生物进化的高度保守基因，编码新生隐球菌4种rRNA分子即5.8s、18s、25s和5s rRNA的基因均已得到克隆，它们在 rRNA基因簇中的排列次序也已确定，即为5s-18s-5.8s-25s。Fan等认为rRNA各亚基在两个变种中顺序一致，且5s rRNA的大小均为118碱基。Perfect等对新生隐球菌的rRNA基因进行染色体定位，发现不同株隐球菌的rRNA基因定位于不同大小的染色体，其分布范围从大于1130kb到小于2000kb。
3、调控基因
为了仔细分析CAP59基因的功能区，Chang等将CAP59基因置于隐球菌GAL7启动子（pGAL7）控制之下，在数个组成不同的GAL7:CAP59融合基因中，只有一个含有完全CAP开放阅读框架的基因能在半乳糖诱导下转化无荚膜突变株，形成荚膜。这说明整个开放阅读框架是CAP59编码蛋白质所必需的。为了研究新生隐球菌肌动蛋白基因的调控机理，Toffalettit等将新生隐球菌肌动蛋白基因（ACT）的启动子和大肠杆菌（E.coli）的报告基因----b-半乳糖苷酶基因（LACZ）融合起来，构建了一个表达质粒----ACTp:LACZ，通过在体外检测b-半乳糖苷酶的活性来判断肌动蛋白启动子的功能。结果，重组子表达b-半乳糖苷酶的活性，在对数生长期和在隐定生长期是有差别的，又都表现出温度信赖性，即在37℃培养条件下比在30℃培养条件下在更高的表达活性。提示隐球菌肌动蛋白基因受温度调控，同时作者推测还有其它隐球菌基因也受温度调控，这就解释了为什么“37℃能存活”成为隐球菌致病因素之一。人们已经发现，真菌基因的转录调控系统不同于哺乳动物或植物，但Zhang等在研究新生隐球菌毒性基因----CNLAC1的同时，却发现它的调控机理非常相似于哺乳动物或植物，即通过阻断转录起点上游区域多个DNA结合位点和利用富含谷氨酸的增强子（如Sp1）来达到调节基因转录的目的。
三、分子流行病学
对于感染性疾病来说，流行病学资料是非常重要的。它是确定感染源和传播途径的重要基础，也是制定群体预防措施的重要依据。早在20世纪80年代末和90年代初，就已应用分子技术对新生隐球菌进行分型研究。这些分子流行病学实验方法包括：多位点酶电泳分型、脉冲电场凝胶电泳核型分析、限制性片段长度多态分析（RFLPs）DNA指纹图谱、线粒体DNA探针和随机扩增多态性DNA分析（RFPD）等。
尽管在体外培养时，临床分离株和环境分离株的带型是相对隐定的，但新生隐球菌在一定的环境压力下还是表现出遗传的多态性。某些菌株的基因型与生俱来就不如其他菌株隐定。这种快速变化的遗传多态性，在微卫星水平和大片段DNA水平（染色体）都有所表现。因此在使用非常敏感的基因分型方法时，需要考虑新生隐球菌在一定的环境和宿主压力下微进化的现象。
RAPD分析是一种利用随机合成的单个寡核苷酸引物通过PCR反应扩增靶细胞DNA。扩增产物经凝胶电泳，分析DNA片段大小和数量多态性，从而比较靶基因差异的一种技术。RAPD自1990年问世以来，已陆续用于酵母菌和丝状真菌的定型、分类和流行病学研究。这一方法适用于真菌各秩级的分类学研究，因为真菌基因组庞大，RAPD能对整个基因组序列做大致的分析，特别适用于分子生物学研究甚少、不了解基因组DNA序列的真菌。它借用的基本方法是PCR技术，操作简便、迅速，便于大规模使用。
Meyer等用（GTG）5、（GACA）4和噬菌体M13编码顺序（GAGGTGCGGCTCT）作为RAPD的随机单引物，对42株新生隐球菌进行研究。发现RAPD标志（亦称PCR指纹）具有高度重复性，且在种、变种和单个菌株水平上存在差异。新生隐球菌新生变种的A、D血清型的指纹截然不同，而格特变种的B、C血清型其指纹则不易区分。格特变种的两种血清型比新生变种的两种血清型在遗传学上更为同源。温海等用（GTG）5、（GACA）4和（GATA）4为引物，PCR扩增30株来自意大利米兰的新生隐球菌临床分离株和野生株、12株来自中国上海的临床分离株标准株。结果能清晰地区分隐球菌的不同种、不同血清型及相同血清型的不同株，与Meyer的报告相似。顾菊林等以（GACA）4作为RAPD的随机单引物，分析了11株新生隐球菌标准株和14株新生隐球菌临床分离株，结果显示（GACA）4引物产生的PCR指纹在新生隐球菌的种、血清型和株水平上呈现明显特征性差异。实验还发现1例隐球菌复发病例，其初始分离株和复发分离株其PCR指纹相同，说明为同一菌株，提示隐球菌的复发是原始菌株的复燃所致，而不是新菌株的感染所为。作者认为RAPD分析可以发展为一种对新生隐球菌进行分类鉴定和流行病学调查的工具。
尽管序列测定非常花费时间，但特殊的基因序列分析已被用来检测新生隐球菌的多态性和区分不同菌株。现已明确新生隐球菌菌株之间存在DNA序列变化。例如，单拷贝的URA5基因在单个菌株和两个变种之间就有广泛的碱基对替换，最高可达基因编码序列的6%。碱基对的替换通常发生在密码子的第三个核苷酸或是在内含子部份，因此蛋白质的结构并没有发生改变。重组的新生隐球菌拓扑异构酶Ⅰ基因，其碱基顺序在血清A 型株T 在型株之间存在着3.6%的差异。有实验证明，新生隐球菌具有基因替换重组能力。在新生隐球菌多基因家族的补充调查研究中，发现有两个泛素基因，UBⅠ1和UBⅠ2，位于不同的染色体上。对其进行序列测定，发现两个基因的重复片段的核苷酸序列有很大的差异（大约有15%）,包括编码位点和内含子数目也存在差异。重复序列发生如此高频率的重组，其确切机制目前还没有阐明。事实上，还不了解是否存在或存在多大程度的甲基化，才可能影响新生隐球菌的基因表达，和/或改变RFLP带型。但是，从序列资料的研究中已明确新生隐球菌存在许多的基因转化和/或重组事件，依此可建立基因序列水平上鉴定菌株的敏感方法。
作为最终分析结果，用几种不同的分子生物学技术对新生隐球菌进行鉴定是明智之举。Brandt和美国隐球菌监测组在鉴定33株隐球菌时，采用了多位点酶电泳、电泳核型、RADP技术和CNRE-1探针等多种方法，发现技术方法和分离菌株之间有一定的相关性，在一个方法中出现的差异可以用另外一种方法补偿纠正。必须强调的是，选择不同技术方法时要注意到，能够真正地检测到感染导致菌株微进化的方法和缺乏鉴别菌株差异的方法之间的平衡。总之，多种分析技术联合应用可以很好地鉴别新生隐球菌。
四、分子诊断
早期的检测手段主要是DNA探针技术。习惯上总是尽量选择基因组中拷贝数较高的序列做探针，这样的探针具有较高的敏感性，所以都选择重复序列片段作为DNA探针，如rDNA探针。自PCR技术诞生之后，用DNA探针直接进行DNA-DNA杂交的做法便被淘汰。从理论上讲，PCR技术可检测到单个菌细胞。现在通常的作法是将DNA探针用作PCR反应中的靶DNA，经过引物设计，直接建立PCR诊断方法。
Polacheck等以pBluescript SK质粒为载体，以大肠杆菌DH5为宿主，构建了血清D型新生隐球菌基因文库，从中筛选获得一段1.0kb的种特异性的中度重复顺序及300bp的特异性的DNA片段。吴建华等以pUC18为载体，以大肠杆菌JM103为宿主，构建了血清A型标准株DNA克隆库，并从中筛选出了3个特异性片段：种特异性、变种特异性和A型特异性片段。其中种特异性探针为多拷贝序列，长500bp左右，适合用于PCR反应模板。顾菊林等建立套式PCR检测隐球菌：应用双引物系统进行套式PCR扩增，第一步应用外侧引物可以诊断常见的病原真菌，能对代表8属17种的25株医学真菌进行扩增，而对所有细菌和人DNA均为扩增阴性；第二步应用内侧引物仅对新生隐球菌获得扩增，11株新生隐球菌均为扩增产生预期长度136bp的特异性片段，21株非新生隐球菌扩增阴性。作者用上述方法对保藏的37份CSF标本进行了回顾性研究，结果表明，若以涂片法或/和真菌培养阳性作为判别有无新生隐球菌存在的“0金标准”，PCR检测法的敏感性为100%，而真菌培养的敏感性仅为74%.PCR法检测的特异性为93%，与传统方法检测结果有较好的符合率。
五、分子种系发生学
随着基因组研究的不断成熟，应用DNA序列信息将更有力地说明真菌之间的种系发生关系。高度保守的rRNA和rDNA是分子种系发生学研究的重点，新生隐球菌的这些基因序列已被进行了研究。在新生隐球菌中，在8kb的重复DNA片段中，按顺序排列着16s、5.8s、23s基因，而且按照同样的方向转录。Fan测定了新生隐球菌的16s和23s rRNA基因序列，并且利用这些序列建立了新生隐球菌和其它真菌之间的系统进化树状图。Gueho通过分析rRNA大亚基最可变区的部份序列，构建了新生隐球菌与属内其他种隐球菌的亲缘关系进化树状图。在这个种系发生树状图上，可以发现新生线状黒粉菌血清A型和其他3个血清型相比有细微的进化差异，有人推论它可能是按照不同的进化速率发展的。
目前的研究主要集中在，研究其他基因及分析其祖先起源上。Cox等通过分析高度保守的肌动蛋白基因，调查了新生隐球菌的种系发生学关系，用这个基因序列可以将新生隐球菌归类到真菌进化的一个单独分支，但是还需要测定更多的其他真菌的肌动蛋白基因序列来进行深入的亚群比较，并利用庞大的rRNA数据库资料进行对照修正。
隐球菌分子进化研究的另一个有意义的用途是确定相关菌种间特异性遗传毒力因子的差异。新生隐球菌是新生线状黒粉菌的无性世代，是线状黒粉菌科中唯一的有动物致病性的菌种，也是担子菌中主要的人类致病菌。如现有的研究工作发现，用探针和其他异种担子菌基因组杂交时，不能检测到新生隐球菌荚膜基因（CAP59）和漆酶基因（CnLAC1）,在能够产生荚膜的菌种中，如银耳、罗伦特隐球菌，也没有发现与CAP59同源的基因。同样用产黒素的CnLAC1基因作探针与其他几种异种担子菌杂交，也不能发现同源基因。这些结果提示，编码荚膜和漆酶的原始基因要么在进化的早期就已形成，要么是一群相关的真菌为适应不同生态压力产生的明显分岐。为了进一步了解其他异种担子菌和致病性新生隐球菌的亲缘关系，可以对毒性因子的进化进行深入研究。
Boekhout等用一系列分子生物学分型方法研究了新生隐球菌两个变种的环境、动物和临床分离株，结果两个变种在染色体数目和大小、RAPD等方面存在着显著的差异，这些差异使得Boekhout怀疑两个变种其实代表不同的种。目前许多争论，认为新生变种和格特变种具有独立的特性，它们的基因型的确存在着明显的差异，深入的分子生物学研究也证明这两个变种之间存在着遗传学上的交叉。
