实时荧光定量PCR检测及临床应用
实时荧光定量PCR技术的应用
定量PCR是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Appliedbiosystems公司推出，它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用对荧光信号积累的实时检测来监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
1. 分子生物学研究
⑴ 基因表达研究：细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，包括对淋巴细胞激活、增生、分化、存活和凋亡的调节。这些低分子蛋白由淋巴细胞、单核细胞和内皮细胞所分泌，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥反应等有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用PCR检测细胞因子mRNA表达水平就显得很有意义。实验研究表明：定量结肠直肠癌淋巴结的癌抗原mRNA的表达量，可以作为诊断癌症微转移的重要依据。
⑵ 单核苷酸多态性(SNP)及突变分析：实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基因突变和基因组的不稳定性。基因突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变位点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交，两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交便会降低杂交体的稳定性，从而降低其熔解温度(Tm)。这样便可对突变和多态性进行分析。拉米夫定是有效治疗慢性乙型肝炎的抗病毒药物，但临床应用中不断有病毒变异的报道，这些变异可能是治疗失败或病毒对治疗无反应的原因。实时荧光定量PCR可以监测乙型肝炎患者服用拉米夫定后体内是否产生耐药突变病毒。
2. 医学研究
⑴ 病原体检测：目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
⑵ 产前诊断：到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。
⑶ 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。
⑷ 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现，荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。
定量PCR技术对临床医学的意义
定量PCR技术有操作方便、好学易懂、检测精确、出结果快而可靠等优势；尤其适合临床应用和推广。
核酸是生物大分子，是一切生物的遗传物质，担负着生命信息的储存和传递。核酸分为两种，DNＡ和RNA。DNA分子由两条螺旋的多核苷酸链组成，两条链的碱基通过腺嘌呤（A）―胸腺嘧呤（T），鸟嘌呤（G）―胞嘧呤（C）之间的氢键连接在一起。这两条链是互补的。DNA以半保留方式进行复制。
病原体基因扩增常用于检测及鉴定微生物，评价治疗反应和检测耐药性突变等。对感染性疾病的评价PCR已证明在许多情况下较传统方法更为优越，尤其是在鉴定不易培养，生长缓慢或不能培养的病原体时候，PCR可以快速（1~2小时内）提供诊断结果，并能同时分析多种样品；同时PCR不受药物治疗的干扰，可在治疗开始后确定感染原，为用药提供可靠的参考。
PCR几乎可以用任何组织或体液，包括新鲜与存档的手术标本来诊断疾病。DNA是相对稳定的分子，可从木乃伊或冷冻的组织中获取标本。指数扩增使得PCR具有极高的灵敏性，而独特的引物使用使其具有高度的特异性，且引物的使用保障了PCR技术不象其他传统的检测方法为提高特异性而牺牲灵敏性。
目前PCR应用于临床主要集中在从病原体和患者基因组中扩增与检测具有诊断参考价值的DNA片段。
定量PCR技术对临床应用的实际意义：
一、早期诊断
免疫学主要是抗原抗体反应，应用于临床通常是在体内产生抗体以后，而许多病原体的抗体产生存在较长的“窗口期”，不利于对疾病的早期诊断；但PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”。以HCV为例，免疫学检测的“窗口期”平均长达70天，而荧光PCR可将“窗口期”缩短59天，显然有利于疾病的早期诊断。
对于乙肝、丙肝和艾滋病患者，目前临床上最常用的检测手段就是血清免疫学检测，也就是检测患者对病毒侵染机体产生的免疫反应，因此血清学检测指标可间接反映病毒的感染情况；而DAN/RNA则直接反映病毒本身在机体内的存在情况。随着检测水平的不断提高，人们越来越意识到两者既相关又不尽相一致，临床上需要将两者结合起来对患者进行诊断、治疗和预后等判断。（据2000年9月西安第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议讨论修订«病毒性肝炎防治方案»乙型肝炎诊断标准如下：有下列任何一项阳性，可诊断为现症HBV感染：1）血清HBsAg阳性；2）血清HBV DNA阳性；3）血清抗-HBcIgM阳性；4）肝内HBcAg阳性，或HBV DNA阳性。丙型肝炎的判断标准如下：1）急性丙型肝炎诊断 临床符合急性肝炎，血清或肝内HCV RNA阳性；或抗-HCV阳性，但无其它型肝炎病毒的急性感染标志。2）慢性丙性肝炎诊断 临床符合慢性肝炎，排除其它型肝炎，血清抗-HCV阳性，或血清和/或肝内HCV RNA阳性），从以上的标准可以看出以PCR方法检测的病原体核酸的存在已成为临床诊断的重要的指标。
人体在感染HBV、HCV、HIV等病毒的早期（急性期），首先能在血清或血浆中检测到的是病毒核酸（DNA/RNA），而相应的病毒抗原抗体常常会在一段时间内无法检出，在医学上成为“窗口期”。实际上也就是在该段时间内机体已经感染了病毒，而“两对半”、HCV抗体、HIV抗体检测却无法显示出阳性结果。而检测病毒核酸可不同程度的大大缩短“窗口期”，以HCV为例，如果检测HCV RNA可以帮助临床医生提前41―60天发现被感染的状况（见下表）
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项目 |
“窗口期” |
核酸检测缩短的“窗口期”的天数 |
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HBV |
56 |
6-15 |
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HCV |
70 |
41-60 |
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HIV |
22 |
10-15 |
因此HBV DNA、HCV RNA、HIVRNA的检出对于该三种病毒感染的早期诊断和提高输血安全性及器官移植后预防病毒感染等是十分有意义的。
性病如淋病、非淋病性尿道炎等很大一部分是由淋球菌（NG）、沙眼衣原体（CT）等所引致的，结核杆菌则是结核病的致病菌。这些病原体的检测在临床上通常采用镜检、培养等方法。镜检的方法操作简便，能较快地提供结果，但是由于方法较为粗造，容易造成假阳性结果，同时灵敏度较低也不能满足临床要求；培养方法是以上病原体检测的“金标准”，但通常培养要求高，例如淋球菌比较娇嫩，体外常会因为标本运输不当造成培养阴性结果，结核杆菌的培养中因细胞壁缺陷菌及化疗后受到损伤的细菌均可导致培养的失败；培养方法通常耗费时间，以结核杆菌为例，培养通常需要2-4周才能有菌落生长，十分不利于临床上的及时诊断和用药，荧光定量PCR方法具有其它方法不可比拟的高灵敏度，可检测到被测样本中一到几个病原菌的DNA，通常只需要半天时间就可出具报告，可很大程度上弥补以上两种方法的缺陷。例如引起尖锐湿疣或与宫颈病变有显著相关的人乳头瘤病毒（HPV），PCR检测DNA是其感染的唯一确诊手段。
HBV、HCV、HIV等病毒可在血液中相对稳定均匀地分布，因此其在血液中的含量变化可直接反映出病毒复制的多少。而TB主要是经呼吸道传播，NG、CT等主要是经性传播，主要集中分布于发病部位，临床上检测通常对其好发部位进行局部采样，TB主要是采集肺部痰液，而NG、CT等主要是采集生殖道分泌物。由于该类标本难以实现采样量的前后一致，TB还存在间歇性排菌等因素，因此无法实现真正的定量，临床上要求出具定性报告，以阴性（-）或阳性（+）表示是否有对应的病原体。
二．药物疗效观察
对病原体的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时地提供直接证据；而荧光定量PCR检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接的依据，以供治疗方案参考；同时药物治疗中可能引起的基因变异等情况更依赖核酸检测提供的直接证据。
三．病情判断和预后评价
评估受侵器官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往预后不好。因此对病原体的定量PCR检测对病情和预后评估均有参考意义。
四．加快疾病的诊断
许多病原体到目前为止仍旧依靠传统的细菌培养作为诊断手段，操作繁琐费时。以结核杆菌为例，传统培养法需要1~2个月，而荧光PCR可将检测时间缩短至半天，能更及时地为临床提供诊断依据。
五．疾病的发病监控
许多病原体尤其是病毒病原体可以在感染人体后整合入细胞基因组内而成为整合型，而一旦机体的免疫力下降等又重新进入活动期并引致发病，临床上希望通过检测病原体基因的数量变化并结合临床表现找出其活动以及是否引起发病的规律。荧光定量PCR可以为此提供直接证据。
六．遗传疾病的诊断
荧光PCR可以实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测。对产前诊断具有其它方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。
