核酸内切酶的影响及因素
限制性酶切反应速度与底物的性质有很大的关系，底物的单双链结构、分子的构型、DNA链中酶识别位点的数目以及位点附近的序列等都影响着酶的催化反应。共价闭合环(超螺旋构型)DNA比其相应的线性分子的酶解作用要慢，要使超螺旋构型DNA彻底降解，需要的酶量就大。对于DNA-RNA杂合双链的酶切作用，Molloy等用EcoRI等8种酶切时，结果其 DNA链可被切割，但酶用量比双链DNA大20-50倍。部分限制性酶还可切割单链DNA，如 Hae Ⅲ等。
每一种限制性酶都有自身的识别特异性，在通常酶反应条件下，特异性不会改变，但在特殊条件下，某些酶的特异性会随之改变，如当反应缓冲液的pH由7.5升高至8.5，或甘油浓度超过5%，或用Mn艹代替Mg艹时EcoRI的识别序列由原来的GAATTC变为AATT，结果是DNA链上切点数量增加，产物片段变小，因此在不合适的反应条件下，限制性酶可表现与原来特异性不同的第二活性。所以在酶切分析中，要确保酶解条件，注意底物DNA的纯度，尽可能防止酶的第二活性。
反应液中盐的浓度是至关重要的，因此要根据所使用的酶来确定盐的浓度。限制性酶对镁离子的要求并不严格，5-30mmol/L均可作用。限制性酶的用量，一般为每微克DNA 1-5单位，为保险起见以过量3-5倍为宜，但最好先作预实验。
从理论上讲，延长反应时间可以节省酶，但长时间消化受酶的稳定性、杂酶的影响等因素的制约。国产酶不宜超过1.5小时，其他酶一般也以1-2小时为宜。酶切反应的温度一般在 37℃，只有少数酶要求特殊反应温度，如TaqⅠ要求65℃。低于37℃时大部份酶仍有活性，如EcoRI在5℃仍有活性。许多酶可用热处理(65℃)10-15分钟使酶反应终止，但并非所有酶都能热终止，不能热终止的酶可用过量EDTA终止或用酚提取来终止。
