核酸内切酶的操作步骤及应用
1.操作步骤 以动物病毒为例说明酶切反应步骤。
(1) 病毒DNA的提取和纯化 当繁殖病毒的细胞出现80%-100%的细胞病变时(CPE)，收获并冻融三次使细胞破裂释放出病毒，3 000r/min离心10分钟，吸出上清，加10% SDS至终浓度为1%，于56℃水浴作用30分钟，加等体积的饱和酚，混匀10 000r/min离心10-15分钟，取上清反复抽提至界面无蛋白质为止，取上清用乙醚去酚数次，真空除去乙醚，然后加2.5倍预冷无水乙醇，沉淀核酸，12 000r/min离心后，核酸沉淀再用70%乙醇洗涤两次，pH8.0 TE缓冲液溶解，取少量用紫外分光光度计测其含量和纯度，其余置－20℃贮存备用。
(2) 酶切反应 将病毒DNA用TE溶解为大约0.5μg/μl。然后依次加入5μl 10×酶切缓冲液（50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH7.8，10mmol/ L MgCl2，1mmol/L DTT），5μl DNA，2μl限制性酶(1-5μl/μg DNA)，用灭菌双蒸水补足至50μl，在振荡器上温和振荡几秒钟，然后稍稍离心(3 000r/mmin)数秒，以使管壁液体集中于管底，37℃恒温水浴中孵育1小时，65℃水浴作用10分钟，或用EDTA终止反应。
(3) 电泳 依据酶切片段的大小选择不同浓度的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶作为支持物进行电泳，同时加入标准DNA作分子量参照物，经溴乙锭(EB)或硝酸银染色，在相应的光源下观察结果并拍摄记录电泳图谱。
以上为酶切反应操作的基本过程。如果进行多酶切反应，则要考虑反应缓冲液要基本适用于所用的各种酶。若两种以上的酶对缓冲液要求不同，如盐浓度要求不同时，先进行低盐要求的酶切反应，再进行高盐要求的反应，对反应温度要求不一的也是先进行低温度酶切，再进行高温度酶切。
2.酶切分析应用限制性核酸内切酶在分子生物学研究中占有极其重要的地位，几乎每一个研究领域都离不开限制性内切酶，其应用非常广泛，如病原微生物DNA分析；DNA序列分析，将庞大的DNA分子切割成小片段便于序列分析；DNA重组和组建新质粒；建立DNA的物理图谱等。
用限制性内切酶分析(Restriction EndonucleaseAnalysis REA)病原微生物DNA已成为一种常用的方法，通过酶切消化DNA，然后电泳染色呈现大小不一的片段，对这些片段的迁移率及数量进行分析，便可了解到病原微生物遗传物质的一定特性，在此基础上采用双酶切割或杂交等方法，则可推测出片段的排列顺序和酶切位点，从而推断出DNA间存在的相似性或差异性，对于动物病毒尤其是对疫苗毒、野毒及变异毒株的检测具有重要的意义。
