报道基因活性的同位素分析实验——CAT活性的层析分析法
报告基因 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,也就是说,是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控,筛选得到转化体。
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 100 mm 培养皿中的转染了CAT表达质粒的贴壁细胞,用PBS洗两次,每次5 ml每培养皿加入1 ml TEN溶液。将细胞置于冰浴5 min。
2. 用橡胶细胞刮子将细胞从培养皿上刮下来,将其转入一只1.5 ml 的微量离心管中,置于冰浴5 min。
6. 在下面混合液中分析20 μl 细胞提取液 2 μl 200 μCi/ml [14C]氯霉素
7. 对于每组分析,在微量离心管中加130 μl 上述混含液和20 μl 提取液,轻轻混匀。 37℃温育1 h。
8. 加1 ml 乙酸乙酯至反应液中,在漩涡混合器上混匀。离心1 min,移出上层液相(乙酸乙酯)在Speedvac蒸发器中蒸干乙酸乙酯45 min。
11. 在盛有200 ml 19:1氯仿/甲醇的平衡过的层析缸中展开色谱,进行2 h 或至溶剂的前沿接近薄板的顶部为止。取下TLC薄板,在空气中晾干。用放射性墨水笔作上标记后,用塑料薄膜包裹,置于感光片上进行放射自显影。
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