RNA足迹和修饰干扰分析实验
实验方法原理 RNA 足迹和修饰干扰分析（RNA footprinting and modification interference analysis）是用来研究 RNA 与蛋白质相互作用的技术。RNA 测序及其结构分析的原理是 RNA 足迹试验的理论基础，它们都是建立在变性、半变性或自然条件下采用碱基特异性 的试剂来切割用放射性同位素标记了末端的 RNA 的方法之上。
实验材料 蛋白酶 KNTPαS 复合物
试剂、试剂盒 RNA 酶抑制剂RNase T1RNase V1RNase T2苯胺柠檬酸乙醇硫酸铁铵抗坏血酸钠EDTANaAc硫脲焦碳酸二乙酯N-乙基-N-亚硝基脲硫酸二甲酯无水肼
仪器、耗材 硅烷化离心管
实验步骤
一、材料与设备
1. RNA 酶抑制剂 ( RNasin 等）。
2. RNase T1。
3. RNase B.cereus ( Bc )。
4. RNase V1。
5. RNase T2。
6. 蛋白酶 K。
7. 重蒸酚、酚：氯仿 ( 体积比为 1：1 ) 和氯仿。
8. 苯胺。
9. NTPαS 复合物（New England Nuclear-Dupont 公司）。
10. 0.5 ml 和 1.5 ml 的硅烷化离心管。
11. 0.1 mol/L 柠檬酸。
12. 乙醇。
13. 0.4 mol/L 硫酸铁铵（ammonium iron sulfate )。
14. 2 mol/L 抗坏血酸钠。
15. 0.8 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )。
16. Fe-EDTA。
17. 0.6% 的 H2O2（V/V）。
18. 0.3 mol/L NaAc（pH 3.8）。
19. 20 mmol/L 硫脲（thiourea )。
20. 焦碳酸二乙酯（DEPC )。
21. N-乙基-N-亚硝基脲（小心操作，强致癌性）。
22. 硫酸二甲酯 ( DMS )。
23. 3 mol/L NaAc（pH 4.5）。
24. 200 mmol/L NaBH4。
25. 无水肼。
26. 纯净的双蒸苯胺，使用前在氮环境下重蒸并避光储存在 -20℃ 氮环境中。
27. 1-丁醇。
28. 1%（m/V）十二烷基硫酸钠（SDS )。
29. DEPC 处理 H2O：1 ml DEPC 加到 1 L 水中，剧烈振荡放置过夜，高压灭菌。
30. 10X RNA-蛋白结合缓冲液：依据分析的蛋白不同而不同，详见注意事项。
31. 小牛肝 tRNA：37°C 同 50 μg/ml 的蛋白酶 K 孵育 2 h，抽提，乙醇沉淀，重新溶解使终浓度 10 mg/ml。
32. 1.5X 凝胶上样缓冲液：10 mol/L 尿素，1.5X TBE，0.015% ( m/V）溴酚蓝，0.015% ( m/V ) 二甲苯青，1% SDS，过滤除菌并储存在 -20℃。
33. 10X 羟基缓冲液：50 mmol/L NaHCO3/Na2CO3（pH 9.2），1 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )，过滤除菌并储存于 -20°C。
34. 2X 抽提缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4)，300 mmol/L NaCl，0.05 % NP-40，10 μg/ml tRNA，1% SDS，过滤除菌并储存于 -20℃。
35. 2X 羟基终止/抽提缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4)，300 mmol/L NaCl，0.05% NP-40，10 μg/ml tRNA，1% SDS，20 mmol/L 硫脲，过滤除菌并储存于 -20℃。
36. 新饱和的 N-乙基-N-亚硝基脲（N-ethyl-N-nimxsoure，ENU ) 溶液：将过量的 ENU (小心操作，强致癌性 ) 加入到 100 μl 乙醇中，离心除去未溶解的 ENU，上清用做碱基修饰试剂。
37. 10X ENU 修饰缓冲液：500 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0)，10 mmol/L EDTA，过滤除菌并储存于 -20℃。
38. I2 储存液：用乙醇配制成 10 mmol/L。
39. 2X 硫酸二甲酯抽提缓冲液：50 mmoI/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，300 mmol/L NaCl， 0.05% NP-40，10 μg/ml tRNA，1% SDS，125 mmol/L 巯基乙醇，过滤除菌并储存于 -20℃。
40. 肼/0.5 mmoI/L NaCl 和肼/3 mmol/L NaCl：将 NaCl 溶解在无水的肼中配制成合适的浓度。
二、操作方法
要成功的进行 RNA-蛋白相互作用的足迹和修饰分析试验，必须首先建立特异 RNA-蛋白相互作用的条件并了解它们的结合特点。核酸酶足迹通常能得到 RNA-蛋白复合物的低分辨率信息，核酸酶在较为广泛的条件包括在生理条件下都有明显的活性，而化学修饰试剂在某些情况下则要求更为严格的条件。然而核酸酶相对较大，其活性可能受到邻近碱基的影响，化学探针远远小于核酸酶，接近于溶剂大小，所以对 RNA-蛋白的相互作用能够提供更精细的信息，为了能全面的了解 RNA-蛋白质相互作用特点，最好的手段是首先釆用核酸酶定位相互作用的位点，然后釆用化学探针和修饰干扰分析来研究相互作用的方式。
进行修饰干扰研究，首先必须有一种可靠的方法从 RNA-蛋白结合反应液中分离 RNA-蛋白复合物，通常采用凝胶迁移分析、滤膜结合（filter bonding）和免疫共沉淀方法来分离 RNA-蛋白复合物，关键是不能破坏 RNA 与蛋白质之间的结合。本实验要求使用 经凝胶纯化后仅有一端被标记的 RNA。末端标记适合于小于 200 个核苷酸或者相互作用的区域在 200 个核苷酸之内的 RNA 分子，对于大于 200 个核苷酸或者是相互作用的区域在 200 个核苷酸以上的 RNA 分子，最好采用反转录酶进行引物延伸来鉴定切割位点。
1. RNA 酶足迹分析
RNA 酶足迹分析可以给出与蛋白质相互作用的 RNA 区段的低分辨率的图谱，在进行足迹反应以前，要确定核酸酶的浓度以便使大约 10 个 RNA 分子中只有一个被切割，这可以通过在 RNA-蛋白结合缓冲液中采用不同的酶浓度和不同的切割时间来实现。现在有一系列位点特异 RNA 酶可以用来进行 RNA 足迹，例如进行病毒相关的（VA ) RNA1 和双链的 RNA 依赖的蛋白激酶（PKR ) 的足迹试验，RNase T1 ( 0.00012 U/5 μl 反应体系），T2 ( 0.003 U/5 μl 反应体系）和 Bc ( 0.25 U/5 μl 反应体系）用来进行单链区的作图，RNase V1 ( 0.006 U/5 μl 反应体系）用来进行结构区的作图，RNase V1 可以识别 4 到 5 个或更长核苷酸形成的短的螺旋区，因此常被使用。大约 50~100000 计数/反应（用 Cerenkov 计数法测定）的 5' 或 3' 末端标记的 RNA 足够进行几个凝胶电泳和保持较短的放射自显影时间。
(1) 对于实验中所使用的每一种核酸酶进行如下反应：设置没有 RNase 的对照，对于每一种酶使用―系列的浓度，在有 MgCl2 （自然状态）或无 MgCl2（半变性状态）条件下进行实验，RNase V1 例外，因为该酶活性的发挥必须有 Mg2+ 的存在。
(2) 每一个反应加 1 μl 10X 结合缓冲液，1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA，末端标记的 RNA，1 μl 稀释的 RNase，加 DEPC-H2O 到终反应体积 5 μl，在 37℃ 孵育 15 min，然后加入 1 μl 10 mg/mg tRNA 和 10 μl 的 1.5X 凝胶点样缓冲液。
(3) 用 10X RNase T1 68℃（变性条件）消化 5 min，使每一个 G 都被切割，产生一个测序梯带。
(4) 采用强碱裂解产生以一个碱基递增的水解梯带：1 μl 10X 羟基缓冲液，1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA，末端标记的 RNA，加 DEPC-H2O 至终体积 10 μl，在 90℃ 孵育 2 min，加入 1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA、10 μl 0.1 moI/L 的柠檬酸和 24 μl 1.5X 凝胶点样缓冲液终止反应。
(5) 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离产物，对于长的 RNA 可能需要进行几个不同浓度和不同时间的电泳。
(6) 标记的 RNA 可以直接采用放射自显影或者是磷屏检测。进行放射自显影时，将凝胶放在 X 射线片上，用塑料膜包裹，置于暗盒中于 -80°C 进行 X 射线片的放射自显影，如进行磷屏检测时，将凝胶放在 3 M 的 Whatman 纸上，用塑料膜包好，真空干燥，在室温条件下进行磷屏成像。
(7) 确定酶解的条件，使加入的 RNA 有 90%~95% 不会被切割，这有利于下一步的足迹实验。
(8) 在进行凝胶分析之前，应除去反应体系中的蛋白组分。用 DEPC-H2O 稀释反应液到 200 μl，加入 200 μl 的 2X 抽提缓冲液再次分离 RNA，加入等体积的酚：氯仿，振荡几分钟，混匀，用小塑离心机最高速度离心 10 min ( 约 16000 g )，收集上层水相。如前所述加入等体积的氯仿再次抽提，用 2.5 倍体积的乙醇沉淀 RNA，置干冰/乙醇中 10~20 min，4℃ 16000 g 离心 15 min，用预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，用 5 μl 水与 10 μl 1.5X 点样缓冲液重新溶解沉淀。
(9) 没有蛋白的酶解反应液也要同时进行再次抽提和沉淀，为了便于分析，上样时应保持大致相同的量，包括作为对照的抽提后没用核酸酶消化的蛋白-RNA 复合物。
2. 采用对核糖骨架链特异的试剂进行足迹和干扰分析实验
除了化学探针相对较小能够给出相互作用位点更高的精确度以外，使用化学探针进行足迹分析和使用核酸酶进行足迹分析的原理相同。
(1) 羟基
羟基具有中性电荷，是用作化学足迹分析的最小物质，它半衰期短，通常采用序列不依赖的方式对核糖的 1' 或 4' 位进行切割，羟基对双链和单链的 RNA 具有相同的作用，但是核糖骨架链参与的高级结构对切割效率会有影响。这种切割反应比较温和，能够在 广泛的缓冲液、盐、温度和酸碱度条件下进行。与先前的试验一样，在进行 RNA-蛋白复合物的足迹实验以前需要在结合缓冲液中确定切割的条件。
① 准备过滤除菌的 0.4 mol/L 硫酸铁铵，2 mol/L 抗坏血酸钠，0.8 mmol/L EDTA pH 8.0，0.6% H2O2。将 0.4 mol/L 硫酸铵稀释至 0.4 mmol/L，然后同等体积的 0.8 mmol/L EDTA 混合，稀释 2 mol/L 抗坏血酸钠至 20 mmol/L，然后与等体积的 Fe-EDTA 混合物和等体积的 0.6% H2O2 混合。
② 首先在没有蛋白质的条件下消化 RNA 确定得到适当的切割梯带的条件，通过控制加入离子/EDTA/H2O2 混合物的量来调节切割的效率，对于 VA RNA1 最适的条件是等量的消化液加入到结合反应液中，室温下孵育 2 min。
③ 用 DEPC-H2O 稀释反应液至 200 μl，然后迅速加入等体积含有 20 mmol/L 硫脲 ( 羟基消除剂）的 2X 抽提缓冲液终止反应，采用1 “RNA 酶足迹分析” 中第 (8) 步的方法重新回收 RNA。
④ 建立了消化条件后，比较 RNA-蛋白复合物和未结合的 RNA 的切割情况，采用前面所述的方法分析所得到的结果。
(2) N-乙基-N-亚硝基脲
N-乙基-N-亚硝基脲（ENU ) 是一种温和的烷化试剂，能够使骨架链上的磷酸形成磷酸丙酯，这些修饰可以被温和的碱基试剂识别及切割，通过测定未结合的 RNA 来确定反应时间和使用的 ENU 量，建立合适的修饰条件，尽管这种修饰没有位点特异性，而且 RNA 主链参与的高级结构可能对反应产生影响，但是 ENU 能够用于足迹和修饰干扰分析试验。
① 加 2 μl 10X 结合缓冲液，1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA，末端标记的 RNA 或者 RNA-蛋白质复合物，5 μl 新鲜配制饱和 ENU，加水到 20 μl，37℃ 孵育 30 min。用水稀释至 200 μl，加入等体积的酚：氯仿，振荡几分钟混匀，用小型离心机在最高速度离心 10 min ( 约 16000 g )，收集上层水相，如前所述加入等体积的氯仿再次抽提，用 2.5 倍体积的乙醇沉淀 RNA，在干冰/乙醇里孵育 10~20 min，4℃ 16000 g 离心 15 min，用冰预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀。同时用 5 μl 乙醇代替 ENU 作为空白对照。
② 重新溶解 RNA 沉淀于 200 μl pH 3.8 的 0.3 mol/L NaAc 中，然后加入 600 μl 乙醇，在干冰/乙醇里孵育 10~20 min，于 4℃ 16000 g 离心 15 min，用冰预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀。
③ 新溶解 RNA 到 10 μl 的 100 mmol/L 的 Tris-HCl ( pH 9.0) 的溶液中，在 50℃ 孵育 5 min，乙醇沉淀 RNA 并进行变性凝胶电泳分析。
④ 如果要预先对 RNA 修饰进行干扰分析，在第 (1) 步中使用 10X ENU 修饰缓冲液并在 80℃ 孵育 2 min。
(3) 含有硫代磷酸酯的转录物
NTPαS 的 Sp 非对映异构体是噬菌体 RNA 聚合酶的底物，能够与正常的 NTP —样搀入到合成的 RNA 中，硫代磷酸酯（phosphorothioate）对碘/乙醇敏感，可以被其切割，由于碘不带电荷、非常小、反应迅速并且对电泳迁移率没有影响，因此适合足迹试验。这可以作为 ENU 修饰的替代，一来可以加快反应的时间，二来在解释数据时不必进行 RNA 酶测序和降解梯带。
① 合成含有硫代磷酸酯的转录物，进行末端标记并纯化，另外对每一个核苷酸和 0.2 mmol/L （5%）NTPαS 进行一个单独的转录反应，也就是说，对于一个含有 AαS 的转录物必须含有所有的 4 种 NTP，但是也要用 0.2 mmol/L 的 ATPαS 进行一个单独的转录反应。
② 将未结合的 RNA 和 RNA-蛋白复合物在室温下与 1 mmol/L I2 孵育 2 min，进行硫代磷酸酯基闭的切割，同时采用等量的乙醇作对照反应。
③ 用 DEPC-H2O 稀释反应液至 200 μl，加入等体积的抽提缓冲液再次分离 RNA，加入等体积的酚：氯仿，振荡几分钟，混匀，用小型离心机在最高速度离心 10 min ( 约 16000 g），收集上层水相，如前所述加入等体积的氯仿再次抽提，用 2.5 倍体积的乙醇沉淀 RNA，在干冰/乙醇里孵育 10~20 min，于 4℃ 16000 g 离心 15 min，用冰预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，用 5 μl 水和 10 μl 1.5X 点样缓冲液重新溶解沉淀。
④ 在此试验中，由于针对特异的 NTPαS 的切割使得末结合的 RNA 形成测序梯带，从而使凝胶的分析更为容易。
3. 采用碱基特异的试剂进行足迹和干扰分析实验
2 “采用对核糖骨架链特异的试剂进行足迹和干扰分析实验” 中介绍的方法可以对与 RNA 主链作用的蛋白进行研究，然而 RNA 的其他部分如碱基也可以调控特异的 RNA-蛋白相互作用，目前有许多化学试剂可以用来进行试验以获得这些碱基的信息。
(1) 焦碳酸二乙酯
焦碳酸二乙酯（DEPC ) 可以使嘌呤 (A>>G ) 的 N-7 位发生羧乙基化，这种修饰可以被碱基堆积抑制同时也受溶液中二价离子的调节。首先要滴定探针的浓度，此处介绍的操作条件和步骤适合于 VA RNA1。
① 加 2 μl 10X 结合缓冲液，1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA，末端标记的未结合 RNA 或者蛋白 RNA 的复合物，2 μl DEPC，加水到 20 μl，37℃ 孵育 10 min。用水稀释到 200 μl，加入等体积的酚：氯仿，振荡几分钟混匀，用小型离心机在最高速度离心 10 min ( 约 16000 g )，收集上层水相，如前所述加入等体积的氯仿再次抽提，用 2.5 倍体积的乙醇沉淀 RNA，在干冰/乙醇里孵育 10~20 min，于 4℃ 16000 g 离心 15 min，冰预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀。
② 如果要产生 DEPC 测序梯带或者对用来进行干扰分析的 RNA 进行预先修饰，可将 2 μl DEPC、末端标记 RNA、1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA、3.3 μl 3 mol/L 的 NaAc ( pH 4.5 )、1 μl 200 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 混合，加水至终体积 200 μl，90°C 孵育 2 min，加入 25 μl 的 3 mol/L NaAc ( pH 4.5）和 750 μl 乙醇，回收、沉淀 RNA。
③ 第 (1) 步或者第 (2) 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L 的 NaAc ( pH 3.8) 重新溶解，加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA。这些 RNA 可以用作干扰分析、进行修饰位点的切割或变性凝胶电泳。
(2) 硫酸二甲酯
硫酸二甲酯（DMS ) 能够使鸟嘌呤（N7 )、胞嘧啶（N3 )、腺嘌呤（N1 ) 的 N 甲基化，只有 G 和 C 的修饰可以采用 Krol 和 Carbon 所述的碱基切割方法检测到。G-N7 反应可以被碱基堆积抑制，而 C-N3 的反应则可被碱基配对所抑制，此处的条件适合于 RV RNA1。
① 加 20 μl 10X 结合缓冲液，1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA，末端标记的未结合 RNA 或者蛋白与复合物，加水至 200 μl，加 0.5 μl DMS 于 37℃ 孵育 10 min。
② 如1 “RNA 酶足迹分析” 中步骤 (8) 的方法，使用含有 125 mmol/L 的 β-巯基乙醇 2X DMS 抽提缓冲液回收 RNA。
③ 要产生一个 DMS 的测序梯带或者适合干扰分析的预先修饰的 RNA，可将 1 μl 的 DMS、末端标记的 RNA、1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA、3.3 μl 3 mol/L 的 NaAc ( pH 4.5)、1 μl 200 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ) 混合，加水至终体积 200 μl，于 90°C 孵育 1 min。
④ 加入 25 μl 3 mol/L NaAc ( pH 4.5 ) 和 750 μl 乙醇，回收、沉淀 RNA。
⑤ 第 (1) 步或者第 (2) 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L 的 NaAc ( pH 3.8 ) 重新溶解，加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA。这些修饰的 RNA 可以用作干扰分析或者重溶在 100 μl 水中，分为两份，真空干燥。
⑥ 重新溶解一份在 10 μl 1 mol/L Tris-HCl 中，加入 10 μl 新鲜配制的 200 mmol/L NaBH4， 避光在冰上孵育 30 min，进行 G-N7 位点的切割。
⑦ 重溶另一份在 10 μl 冰预冷的 50% ( V/V ) 无水肼中，冰浴 5 min，进行 C-N3 位点的切割。
⑧ 第 (4) 步或者第 (5) 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L NaAc ( pH 3.8 ) 重新溶解，加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA，重复溶解沉淀一次，RNA 用来进行苯胺的切割。
(3) 苯胺切割修饰的 RNA
① 重新溶解 RNA 沉淀在 20 μl 1 mol/L 苯胺（用 0.3 mol/L pH 3.8 NaAc 新鲜稀释），避光于 60℃ 孵育 20 min。
② 加入 1.4 ml 正丁醇终止反应，短暂振荡，室温下在微型离心机上以最高转速离心 ( 约 16000 g )，小心去除正丁醇，重新溶解 RNA 沉淀在 150 μl 1% ( m/V ) SDS 中，加入 1.4 ml 正丁醇，短暂振荡，如前沉淀 RNA。
③ 用无水乙醇洗涤沉淀，完全干燥，重新溶解 RNA 沉淀于 4 μl DEPC-H2O 和 8 μl 的 1.5X 凝胶点样缓冲液，样品准备进行凝胶分析。同时还需用苯胺处理标记的未修饰的 RNA。
4. 修饰干扰分析
使用预先修饰的 RNA 进行修饰干扰分析可以鉴别与蛋白质相互作用的重要位点。DEPC、ENU、DMS 修饰的 RNA 和含有硫代磷酸酯的转录物都可以进行干扰分析。在变性条件下对 RNA 进行化学试剂的修饰可能使所有的位点都被修饰，对修饰后的 RNA 进 行回收并进行结合反应。RNA 蛋白复合物从未结合的 RNA 中分离出来，如前所述进行蛋白-RNA 复合物的抽提。这些 RNA 在修饰位点进行切割，平行进行未修饰的 RNA 试验以便产生一个测序梯带对照，未修饰的 RNA 也作为没有特异结合的对照，采用变性凝胶电泳和放射自显影对产物进行分析。下面给出了采用肼分析嘧啶碱基的修饰程序。
肼可以去除嘧啶碱基用来进行干扰分析，根据选择的条件不同，反应可以针对 U、C 或者二者进行，此处的条件适合于 VA RNA1。
1. 沉淀未端标记的 RNA 和 1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA。
2. 进行 U 特异的反应，重溶 RNA 于 10 μl 的水中，并加入 10 μl 无水肼，在冰上孵育混合物 10 min。
3. 进行 U 和 C 特异的反应同上面所述的相同，只是将 RNA 沉淀重溶在 20 μl 新鲜配制的无水肼/0.5 mol/L NaCl 中，冰上孵育 30 min。
4. 进行 C 特异的反应，将 RNA 沉淀重溶在新鲜配制的无水肼/3 mol/L NaCI 中，冰上孵育 30 min。
5. 第 2、3、4 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L NaAc ( pH 3.8) 重新溶解，加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA，重新溶解沉淀一次，回收沉淀用于干扰结合研究和苯胺切割试验
