多克隆抗血清的制备
材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)
家兔、大鼠、小鼠或合适品系的仓鼠
弗 氏 完 全 佐 剂（CFA; Sigma)
含 1〜2 mg/m l 纯化蛋白抗原的 PBS 溶液：吸取其中 10〜20 Mg，在考马斯亮蓝染色的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析未见有污染的条带VPBS
弗 氏 不 完 全 佐 剂（ incomplete Freunds adjuvant， IFA; Sigma)
50 ml —次性聚丙烯离心管
带 有 19 G、 21 G 和 22 G 针 头 的 3 ml 玻璃注射器
双头同步注射针座连接器或塑料 3 通道旋塞
IOOml 烧杯
1.取一只家兔、大鼠、小鼠或适用于免疫的仓鼠，采血并用 50m l 离 心 管 收 集 血 样（见附 录 2F)。从血样中制备血清，检 测 后 储 存（见辅助方案）。
2.振 荡 CFA 使 不 溶 的 结 核 分 枝 杆 菌 分 散 。 4°C 下 加 2 ml C F A 至 2m l 的 含 0.25〜0.5 mg/m l 纯化蛋白抗原的 PBS 溶 液（足 够 免 疫 4 只 家 兔 或 8 0 只小鼠）。注意不要使 用 Tris 碱缓冲液制备乳化液。
3.将 CFA 和抗原混合物吸入带有 19 G 针 头 的 3 ml 玻 璃 注 射 器（不用塑料注射器）。取下针头，尽可能排出空气，把注射器接到一个双头同步注射针座连接器或一个塑料 3通 道 旋 塞 上（图 1.2.1)。将一个空的 3 ml 玻璃注射器接到另一头并且推压使混合物在两个注射器之间反复来回流动。将其置于冰块上降温，使混合物的温度尽可能时刻保持在 4°C 左右。当混合物变为单相且转为白色时，取下连接器或旋塞，接上一个21 G 的针头，从混合物中挤出一小滴使其落到 IOOml 烧 杯 中 的 50m l 的冷水表面上，由此来检测乳状液是否稳定。如果乳状液在水面上聚成一滴，则 按 步 骤 4 继续进行。如液滴分散，继续混合至乳状液形成。
4.转移全部佐剂-抗原乳状液至某一注射器中，取下连接器和旋塞。在注射器上接一个22 G 的针头并赶走气泡。
5 . 固 定 住 动 物（附 录 2 0 , 分别以肌内、皮内或皮下多部位注射方式给动物注射乳状液（附 录 2E)。对于小鼠，应使用腹腔注射。如果该抗原效果良好，则 将 其 在 4°C 下保存数周，使用之前将其重新乳化，否则弃去未使用的免疫原。
6.对动物免疫 10〜14d 后 ，进行采血并收集血样，制备血清并检测。
7.制备抗原以增强免疫（步 骤 2〜4)。当 CFA 作为初级免疫的佐剂时，使 用 IFA 作为所有后继免疫的佐剂。在免疫之后，于 4 〜8 周 （或 在 第 2 周 ；图 1.2. 2 ) 进行初次增强免疫， 7〜14d 后对动物采血并收集血样，制备血清并检测。
8.每 隔 2〜3 周进行进一步增强免疫，注意避免会导致皮肤溃疡的反复皮内免疫。初次皮内或皮下免疫后，对家兔肌内注射以增强免疫。也可初次肌内注射免疫，增强免疫在其他部位进行。
9 . 每次增强免疫 10〜14d 后对动物采血并收集血样，制备血清并检测。
