蛋白质沉淀(Protein Precipitation)浓缩方法原理及详细解析-2
二．硫酸铵的使用
硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S
饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。
硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出，停止透析。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但手续烦琐，需不断测量饱和度，故多用于结晶，其它情况少见。
使用固体硫酸铵时：1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃或室温两种，加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。
第二节有机溶剂沉淀法
有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。该法优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；3）在生化制备中应用比盐析法广泛。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作要求在低温下进行。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。
有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。
有多种因素影响有机溶剂的沉淀效果：1）温度低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶解度，提高提取效率；2）样品浓度和PH
与盐析法中的作用基本相同；3）金属离子一些多价阳离子如Zn2++和Ca2+在一定PH下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降，而且不影响蛋白质的生物活性。4）离子强度盐浓度太大或太低都对分离有不利影响，对蛋白质和多糖而言盐浓度不超过5%比较合适，使用的乙醇量不超过二倍体积为宜。
第三节其他沉淀法
一．等电点沉淀法
两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调 pH8.0去除碱性蛋白质，再调pH3.0去除酸性蛋白质。
利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH值。等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。
