腺病毒系统使用指南（二）
2.2 rAAV shRNA克隆服务
维真生物为您提供了多种表达shRNA的rAAV，包括U6或H1启动子和作为哺乳动物表达标记的GFP或RFP。同时，也可根据您感兴趣的基因提供shRNA设计服务。
2.3 rAAV载体容量
腺相关病毒载体能够感染分裂和非分裂细胞。毒性和免疫原性低，适合以相对较高的转染效率在非分裂细胞中长期表达和在分裂细胞中短期表达基因。但AAV载体的外源基因容纳量有限，两个ITR之间的空间只有4.9kb，因此可插入的外源基因为3.5kb甚至更小。请参阅本表选择适合您的病毒载体系统。
腺相关病毒颗粒生产流程
第一步：基因克隆。将外源基因克隆进入维真生物公司的人源或shRNA腺相关病毒载体，pAV-FH AAV等载体的多克隆位点与我们的human ORF穿梭克隆相兼容，非常适于哺乳动物ORF的表达。
第二步：细胞转染。将携带外源基因的重组质粒与辅助质粒Ad Helper Vector和pAAV-rep/cap Vector共转染进入HEK293T细胞，感染72h之后即包装完毕。
第三步：收毒。分别收获培养基上清与细胞沉淀，PEG8000沉淀培养基上清中的病毒，培养基上清先用0.45um滤膜过滤。
第四步：病毒纯化。通过碘克沙醇法对病毒进行纯化，一方面提高病毒滴度，另一方面某些动物实验需要纯化之后才可进行。
第五步：滴度检测。用QPCR的方法来检测病毒的滴度，得到的结果为包装得到的病毒颗粒数。
维真生物的pAV-FH AAV载体，具有Amp抗性、CMV启动子，带有Flag-His标签。多克隆位点与维真生物的human ORF穿梭克隆相兼容。非常适于哺乳动物ORF的表达。维真生物为您提供了多种表达shRNA的rAAV，包括U6或H1启动子和作为哺乳动物表达标记的GFP或RFP。同时，也可根据您感兴趣的基因提供shRNA设计服务。
pAAV-rep/cap质粒（图）包含AAV编码复制蛋白和病毒衣壳蛋白的rep和cap基因，获得期望的高滴度病毒产品的关键基因。
pHelper 质粒（图）包含AAV-HEK293T 生产高滴度病毒必须的的腺病毒基因VA，E2A 和E4 的集合。提供AAV 生产所必需的腺病毒蛋白质E1A 和E1B 在HEK293T 细胞中稳定表达。
1.腺相关病毒重组克隆构建
1）根据订单不同选择不同的载体，在此以人源基因克隆为例。
2）维真生物公司的AAV载体与我们的人源ORF库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容，通过酶切，连接，转化的方式将基因亚克隆进入pAV-FH AAV载体，得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性。
2.细胞冻存流程
1)按照培养细胞流程，将细胞吹下来加入50ml离心管中， 800g离心5min。
2)配制冻存液，90% 血清，10% DMSO，混匀。
3)离心后去上清，将配制的冻存液加入，将细胞吹匀
4)取上述溶液1ml分至1.5ml细胞冻存管中，做好标记和日期。
5)放入装有异丙醇的冻存盒中，放入-80度冰箱过夜。（冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温，使异丙醇的温度达到室温，每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上）。
6)第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。
3.细胞复苏流程
1)10cm培养盘中加10cm新鲜DMEM培养基，放培养箱预热至37℃。
2)从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 ℃ ～38℃水浴中，使其融化（1-2分钟左右）。
3)待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中。
4)摇晃均匀，放培养箱培养。
5)4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基（除去冻存液中DMSO对细胞的毒害作用。也可在第3步中800g离心5min，除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的DMEM细胞培养皿中）。
4.细胞培养流程（以10cm细胞培养皿，传代为例）
1)生物安全柜紫外灭菌半小时。
2)灭菌期间，DMEM培养基(含10%FBS，1%青链霉素混合液)、PBS以及0.25%胰酶在37℃水浴锅中预热。
3)取汇合度接近100%活性好的的HEK293T细胞，吸弃培养盘中培养基，加约5ml，1 ×PBS，摇晃几下，吸弃PBS。（加PBS目的主要除去残留在皿中的培养基中的FBS，以提高胰酶的消化效率）
4)加1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜内消化约1min，室温低时可放置于培养箱中消化。消化时间不宜过长，否则影响细胞再次贴壁效率和活性。
5)加入约5ml的预热的培养基。
6)用移液管吹打均匀，按照1:3比例传代。各洗2ml培养基至新的10cm皿中，再加入8ml预热的DMEM培养基。（吹打过程中不可用力过大，否则会吹破细胞）。
注意：传代盘数较多时，要先将预热的DMEM培养基加入到10cm皿中，再加入含细胞的培养基，以避免细胞分布不均。放置于培养箱前轻轻混匀皿中的培养基，使细胞均匀分散于培养基中。细胞培养条件为5%-7%CO2浓度，37℃，培养箱内无菌水盘内水份提供一定的湿度。
细胞传盘以及分6孔板，24孔板，96孔板分细胞都经过上述流程，只是细胞数与分的比例不同，具体情况具体操作。
5.AAV 病毒包装
以10cm细胞培养皿为例
第一天: 聚合度90%以上的HEK293T细胞按1：3比例传盘（每盘大约2.5 x 106），培养基Hyclone高糖DMEM培养基（含10%FBS）。
第二天: 转质粒前1-2h左右，换成无血清培养基（所有血清型AAV），用转染试剂将目的基因质粒和辅助质粒（需用酚氯仿提取的质粒）转入HEK293T中。
第三天：质粒转化24h后，换新的无血清培养基（所有血清型AAV）
第五天：转染72h收毒。带着培养基，吹下细胞，离心；然后分别收获培养基上清与细胞沉淀。用PEG8000沉淀培养基上清中的病毒，沉淀过夜后收集病毒沉淀。
6.AAV病毒纯化
1)收集病毒沉淀和细胞沉淀。
2)细胞沉淀-80℃保存，后续实验用。
3)破碎细胞。
4) 将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。
7.病毒浓缩
用超滤管进行浓缩。
8.病毒滴度检验
1)腺性相关病毒处理破除AAV病毒外壳 ，37 ℃ 孵育30 min，然后加热 95 ℃5 min 使酶失活，体系如下：
组成成分
体积
病毒液
5ul
蛋白酶K（5ug/ul）
1ul
超纯水
4ul
2)离心12000rpm,2min.取上清。
3)标准品的拷贝数，7个梯度稀释浓度分别：7.2E+8V.G./UL,7.2E+7V.G./UL,7.2E+6V.G./UL,7.2E+5V.G./UL,7.2E+4V.G./UL,7.2E+3V.G./UL,7.2E+2V.G./UL.并将超纯水作为阴性对照。
4)配制PCR反应体系，每个样品20 ul体系，体系如下：
组成成分
体积
2X SYBRGreen缓冲液
10ul
F、R引物混合物
0.8ul
超纯水
7.2ul
病毒样品或标准品
2ul
5)PCR反应体系
组成成分
体积
95℃
5min；
95℃
15sec
60℃
15sec
72℃
15sec
40个cycles
6)病毒颗粒数公式：病毒颗粒数（个/ml）= 与标准品相对值 × 1000
