强力粪便DNA提取试剂盒使用说明
强力粪便 DNA 提取试剂盒
货号 | 提取次数 |
12830-50 | 50 次 |
简介
PowerFecal™ DNA Isolation kit 专门设计用于简便快速粪便、肠内容物、生物固体样品微生物和宿主总 DNA。基于 PowerSoil™ DNA Isolation Kit 开发，使用了无论对土壤还是粪便样品同样奏效的ZL抑制因子去除技术（Inhibitor Removal Technology®）。IRT 技术能高效去除常见于粪便样品的多糖、亚铁血红素和胆汁盐等抑制因子。纯净的最终 DNA 可直接用于所有下游实验。
操作预览
粪便或生物固体建议加样 0.25g。样品装入到含有石榴石研磨珠的独立 2ml Bead Beating Tube 中。在研磨珠的机械碰撞和化学试剂对细胞膜的破解作用促使下宿主、微生物细胞裂解，高效的提取效果足以应付最难搞的微生物类型。ZL的抑制因子去除技术（Inhibitor Removal Technology®）接着去掉粪便样品中常见的 PCR 抑制物。总基因组 DNA 吸附到硅胶滤膜上。经过冲洗和洗脱，纯净的最终 DNA 可直接用于 PCR、qPCR、第二代测序等进一步应用。
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PowerVac™ Manifold | 11991 | 1 manifold |
PowerVac™ Mini System | 11992 | 1 unit + 20 adapters |
PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters | 11992-10 | 10 adapters |
11992-20 | 20 adapters | |
设备要求
微型离心机（13000g）
移液器（60μl – 750μl）
Vortex-Genie®2 涡旋仪（MO BIO 货号#13111-V-220）涡旋仪适配器（MO BIO 货号#13000-V1-24）
保存
组分室温（15-30℃）保存。
试剂盒组分
货号：12830-50 | |
组分 | 量 |
Dry Bead Tubes | 50 |
Bead Solution | 42ml |
Solution C1 | 3.3ml |
Solution C2 | 14ml |
Solution C3 | 11ml |
Solution C4 | 72ml |
Solution C5 | 30ml |
Solution C6 | 6ml |
Spin Filters(units in 2ml Tubes) | 50 |
2 ml Collection Tubes | 200 |
△实验前请先逐一检查试剂!
保存
组分室温（15-30℃）保存。
操作步骤
1、加入 0.25g 粪便或生物固体到 Dry Bead Tube 中。
注意：水分、多糖和蛋白含量较高的粪便样品（如胎便、某些鸟类粪便）减少加样量（0.1g）能提高 DNA 得率和纯度。
2、加入 750μl Bead Solution 到 Dry Bead Tube 中。轻轻涡旋混匀。
这一步发生了什么：把样品加入到 Bead Tube 后，下一步就是样品均质化和细胞裂解。石榴石研磨珠和裂解裂解缓冲液可溶解和把样品分散开。
3、使用前先检查 C1 溶液。若有沉淀，60℃水浴直至全部溶解。
这一步发生了什么：C1 溶液含有 SDS。温度较低时会在瓶底形成白色沉淀。60℃水浴可重新溶解 SDS，并且对 SDS 和其它组分性能无损。可趁热使用。
4、加入 60μl C1 溶液，上下颠倒数次或轻轻涡旋混匀。
这一步发生了什么：C1 溶液含有 SDS 和其它裂解试剂可辅助细胞裂解。SDS 是种去垢剂，可降解细胞膜上的脂肪酸和油脂。
5、65℃水浴加热 10min。
这一步发生了什么：粪便样品杂合了许多多糖、脂类、盐和细胞等。加热可加快裂解缓冲液与这些物质的反
应速度，辅助裂解细胞。
6、把 Bead Tubes 水平放置到涡旋仪适配器上（MOBIO 货号：13000-V1-24）。最大转速连续涡旋振荡 10min。
这一步发生了什么：研磨珠与微生物细胞在裂解试剂包围下震荡，可使细胞破裂。MOBIO 的涡旋仪适配器是个简单而有效的附件，在涡旋振荡过程中能把 Tube 管牢牢卡在涡旋仪上。你也可以用胶带把 Tube 管固定在适配器上，但有可能在振荡过程中松脱，影响样品间条件一致性，降低得率。
7、13000g 离心 1min。
8、把上清转移到一个干净的 2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。约可获得 400-500μl 上清。
这一步发生了什么：这一步约可获得 400-500μl 上清液。预期的体积与样品起始量有关，不影响提取效率。
9、加入 250μl C2 溶液，轻轻涡旋混匀。4℃孵育 5min。
这一步发生了什么：C2 溶液为ZL的 Inhibitor Removal Technology®（IRT）的一部分。它含有可沉淀多糖、细胞碎片和蛋白质等非 DNA 的有机和无机物质的试剂。这些有机和无机物质会影响 DNA 纯度并抑制下游实验，必须去除。
10、13000g 离心 1min。
11、避开沉淀，最多只转移 600μl 上清到一个干净的 2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。
这一步发生了什么：沉淀为多糖、细胞碎片、蛋白等非 DNA 有机和无机成分。为获得最佳 DNA 得率和质量，转移上清时避开沉淀。
12、加入 200μl C3 溶液，轻轻涡旋。4℃孵育 5min。13、13000g 离心 1min。
14、避开沉淀，转移上清到一个干净的 2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。转移的上清液不能超过 750μl。
这一步发生了什么：沉淀为多糖、细胞碎片、蛋白等非 DNA 有机和无机成分。为获得最佳 DNA 得率和质量，转移上清时避开沉淀。转移的上清不能超过 750μl，否则会影响后续 DNA 的吸附绑定。
15、C4 溶液使用前先摇匀。加入 1200μl C4 溶液到上清中，涡旋 5s 混匀。
这一步发生了什么：C4 溶液为高浓度盐溶液。可让 DNA 牢牢地选择性吸附到硅胶滤膜上，非 DNA 的有机和无机物质不被吸附，但仍会少量残留在滤膜上。
16、加载 650μl 上清到一个 Spin Filter 中，13000g 离心 1min。弃去滤液，重复加载上清。
注意：一共需要加载 3 次上清。
高通量选项：一次要处理大量样品时，步骤 16 会变得非常耗时。因此 MOBIO 开发出了真空泵抽吸法。需要
额外购买真空泵适配器（MOBIO 货号：11992）。平底 Spin filter 在真空泵适配器帮助下能快速完成滤过动作。
这一步发生了什么：DNA 在高浓度盐环境下选择性地吸附到离心柱硅胶滤膜上。杂质通过滤膜，剩下 DNA 留在滤膜上。
17、加入 500μl C5 溶液，13000g 离心 1min。
这一步发生了什么：C5 是含有酒精的冲洗缓冲液，可进一步冲洗离心柱硅胶滤膜上的 DNA。冲洗缓冲液还能去除硅胶滤膜上残留的少量含和其它杂质。
18、弃去滤液。
这一步发生了什么：滤液不含 DNA。
19、13000g 再次离心 1min。
这一步发生了什么：再次离心去除残留的 C5 溶液（含有酒精的冲洗缓冲液）。含有酒精的 C5 溶液必须全部去除掉，以免影响后续 PCR、消化、凝胶电泳等 DNA 应用。
20、小心把 Spin Filter 转移到一个干净的 2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。避免沾到任何 C5 溶液。
21、加入 100μl C6 溶液到离心柱白色滤膜中心。你也可以用灭菌 DNA-Free PCR 级纯水或 TE 缓冲液从硅胶离心柱上洗脱 DNA。
注意：用 100μl C6 溶液可获得最佳的 DNA 得率。为了浓缩 DNA，C6 溶液使用量最少可以只加 50μl。C6 溶液用量少于 50μl 会严重影响洗脱效率。
这一步发生了什么：把 C6 溶液（灭菌洗脱缓冲液）加到离心柱白色滤膜中心，并润湿整个滤膜才能获得最佳洗脱效果。C6 溶液（洗脱缓冲液）通过滤膜，DNA 在高浓度盐环境下选择性吸附到滤膜上，在 C6 溶液（10mM Tris）低盐环境下洗脱下来。
22、13000g 离心 1min，弃去 Spin Filter。
此时 Tube 管中的 DNA 可直接用于下游实验，无需进一步处理。
DNA 建议-20℃~-80℃冷冻保存。C6 溶液不含 EDTA。要浓缩 DNA，可参考下文疑难点。
感谢选用 PowerFecal™ DNA Isolation Kit!
