peprotech细胞因子注意事项（二）
四、所需试剂
1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂
依据实验需要选择特殊表面标志
CD45圈定所有淋巴细胞
CD3 圈定T淋巴细胞
CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群
CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群
CD19/或CD20圈定B淋巴细胞
CD56圈定NK淋巴细胞
CD14圈定单核细胞
2、荧光标记的细胞因子抗体
R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体
3、溶血素
用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞
4、激活剂
① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）
DMSO中调节浓度0.1mg/mL
L），－20℃储存。勿反复冻融m分装（20
每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液
D.PMA终浓度25ng/mL细胞悬液
② Ionomycin （Alexis，目录号ALX-450-006-M001）
于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL
－20℃储存
每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液
g/mL细胞悬液m③Ionomycin终浓度1
Staphylococcal enterotoxin B（SEB） （Sigma，Catalog No.S-4881）
无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL
4℃储存
g/mL细胞悬液mSEB终浓度10
④ CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞
⑤ CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml
5、阻断剂
阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内
① Brefeldin-A（BFA） （eBioscience，目录号00-4506）
于DMSO中调节浓度5mg/mL
分装（20L），-20℃储存。勿反复冻融。
每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液
g/mL细胞悬液。m激活最后4－5小时BFA终浓度10
注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降
② Monensin （eBioscience，目录号00-4505）
6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640
7、 固定剂
细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目录号00-8222）
8、 破膜剂
含1%皂甙、0.05%叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333）
将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合
9、其它试剂
无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。
