小片段法进行基因分型（一）
摘要：
背景：用于基因分型的高分辨率熔解曲线技术既简单又有效。在以熔解为基础的方法中，探针法是基因分型的黄金标准，可以将等位基因与目标的匹配完全区分开。小片段基因分型法是代替探针的基因分型法。异源双链核酸分子的存在使得检测纯合子变得容易，其熔解峰的形状有明显的改变。纯合子G/C或A/T的基因分型比较困难，因为其等位基因的Tm值相似。这些碱基对改变的纯合子用小片段法很难区分。样品间的温度、buffer和体积的变化限制纯合子的分离。不管仪器是多么精确，用户操作的变化是需要注意的，减少这种变化的方法可以改进小片段基因分型。利用内部特定反应的标准可以克服这些限制。
方法：合成校准的核苷酸，与其互补链的浓度相同。用普通PCR仪进行PCR反应，反应时有LC
Green和内标的存在。PCR反应之后，将其放入LightSanner中，扫描55℃-97℃范围内的数据。标准品熔解的特征是成一条线的，用于转换每个样品的荧光数据。测序之后确认基因型。我们通过测量每个样品的峰形与基因型一致的平均Tm值的距离，评估较正之前和之后纯合子基因分型的错误率。
当样品的Tm值与不正确分组平均Tm值相近时，可以观测到错误。
结果：通过扫描大量的样品板及PCR目标校准，使得碱基对SNP突变的基因分型敏感性从90%增至99%。校准之后，Tm标准差从0.056降至0.027℃。
结论：在小扩增子内用温度内标可以改进G/C和T/A的碱基改变的基因分型。此工作由美国国立卫生研究院的R44DK069106和R44HD053215到SFD和R42GM072419和R42GM073396到CTW资助。
背景：
由于核苷酸的遗传性能，变性或熔解，基因型之间的特征是多样性的。以探针为基础的基因分型有相当大的特定等位基因温度偏移——几摄氏度的优势。高分辨率提供全部双链转换的详细的图，使排除探针法变得可能。另外，检测全部扩增时，可以获得每个实验碱基数目的密度达到20倍的。尽管如此，因为潜在的相似的熔解温度和熔解形状，探针系统检测纯合子是比较困难的。小片段法提供一种简单的基因分型解决方案。
尤其是，小片段熔解提供更好的纯合子检测，因为与大扩增子相比，其特定基因型的Tm值偏移是大的。但是，一些因素可能阻止纯合子的分离。碱基与仪器改变的类型和样品之间偏移引起的Tm可变性可以进行基因分型。校准器减少了许多来源的变化，绷紧熔解转化和增加基因分型的敏感性。当小片段的引物与目的SNP的两侧紧密结合时，可以获得最好的结果。
方法：
PCR反应体系为10ul，包括1×Lightsanner高敏感性基因分型的matermix（Idaho
Technology），包括热启动酶，Mg2+，buffer及其它组分，核酸内标提供独立于PCR的大约在62℃和92℃的熔解曲线。引物包括0.10或0.15um，
人类基因组DNA10-15ng。 PCR反应条件如下：95℃变性2min， 1个循环；94℃ 30s， 63℃-67℃（取决于实验） 30s，
45个循环，结合了退火和延伸。最终的退火步骤是28℃,30s。用探针法分析所有的DNA样品进行基因分型。
在LightScanner96(Idaho
Technology)上进行扫描，收集数据，温度范围为：55℃-97℃。熔解数据通过平滑曲线尺校准之后接近荧光数据。其次，每一个内标存在的Tm值是通过样条数据代数的差值顶点来计算的，应用偏移和直线标尺因素排列每个校准。这个移动过程排列扩增子的熔解曲线，使最小化变小。数据用三次仿样函数曲线尺重新取样，用Lightsanner软件进行分析。分析扩增子Tm值周围的温度范围（用/不用提前校准好的内标），显示派生峰。
-
焦点事件
