肿瘤细胞培养实验
实验材料 细胞
试剂、试剂盒 培养液Hanks胰蛋白酶EDTA胶原酶
仪器、耗材 培养瓶离心管
实验步骤
一、成纤维细胞排除法
1. 机械刮除法
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝），或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。
刮除程序为
（1）标记
镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；
（2）刮除
弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；
（3）用Hanks液冲洗—两次，洗除被刮掉的细胞；
（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。
2. 反复贴壁法
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，井结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。
（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2 次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；
（2）取编号为A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中，置温箱中静止培养5~20 分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；
（3）培养B 瓶中细胞5~20 分钟后，按处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中，再向B瓶中补加完全培养基。
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
3. 消化排除法
此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是
（1）先是用0.5 %胰蛋白酶和0.02 %EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
4. 胶原酶消化法
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。
（1）可用0.5 mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视维细胞被除掉后，即终止消化；
（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
5. 其它方法
有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025~1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23 ℃中800 g离心10 分钟。在比重1.025~1.050层为成纤维细胞，在比重1.065~1.085 层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。
选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。
其他
一、取材
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4 ℃中，但不宜超过24 小时。
二、培养基
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMI 1640、DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤组织完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子，有的还需特异性生长因子（如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
三、成纤维细胞的排除
成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法。
