主要说明定量PCR仪器
定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。从前面的原理介绍不难看出选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管（LED）光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，但是寿命短，更换费用高；而单色发光二极管（LED）价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统，光电二极管（PDT）和光电倍增管（PMT），三者灵敏度依次递增，但CCD可以一次对多点成像，而PDT和PMT一次只能扫描一个样品，需要通过逐个扫描实现多样品检测，对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计，这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。——随着定量PCR技术在临床诊断、疾病监控、药物监测、肿瘤研究等领域的越来越广泛的应用，市面上不同品牌和设计的定量PCR仪也不断推陈出新，在这里着重介绍不同的三类定量PCR仪。
1.传统的孔板式定量PCR仪
传统板式定量PCR仪可以采用96孔板甚至384孔板进行批量的定量反应，但是缺点也显而易见——温度均一性不佳——平板固定加热模块的PCR仪温度控制有边缘效应——样品槽上每个孔之间的温度存在差异——也就是所谓位置效应，因此标准曲线的反应条件难以做到与样本完全一致，样本和样本之间的温度控制也存在差异，对于灵敏度极高的定量PCR来说，任何极微小的差异都会以指数级的规模被放大，不能不说是一种缺憾。传统反应板面积大，温度控制的精确性、升降温速度也相对较慢，因而反应速度也较慢。至于96孔板定量PCR仪的荧光检测分析系统，由于96孔板上样品孔的位置是固定的，每个样品孔距离光源和监测器的光程各不相同，会对结果产生一定影响。检测在PCR管顶部进行，管盖的透光性和厚薄均一性都可能对结果产生影响，因此需要加入Rox染料进行校正。ABI、MJ和Bio-Rad公司的定量PCR仪也属于这一类。
2.创新概念的离心式实时定量PCR仪
为了克服平板式定量PCR温度均一性差的缺点，聪明的研究人员又开发出创新概念的离心式实时定量PCR仪，以Corbett的Rotor-Gene和罗氏的LightCycler为代表。PCR扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样，借助空气加热和转子在腔内旋转，转子上每个孔都是“等位”的，几乎无差别，很好的解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题——Corbett的Rotor-Gene样品间温度差异小于±0.01℃，zui大程度地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性。利用空气做加热介质的优点在于能实现与反应体系无缝接触，接触面积大且加热均匀。虽然有竞争对手批评空气介质比热小，但事实上罗氏的lightcycle2.0却是目前升温速度zui快的定量PCR仪，可以达到20℃/秒！Rotor-Gene也可以达到5℃/秒，优于多数平板式PCR仪。借助旋转离心力还可以随时将可能凝在管壁和盖子上的液滴离心到管底而无需热盖；还可以将酶加在管盖/壁上，升温后离心到管底与反应体系混合，实现“机械的热启动功能”。由于升温速度快，对于常规需要2个多小时完成的定量PCR反应，
Corbett的Rotor-Gene仅需40-60分钟即可完成，大大节约时间和提高工作效率。这一点对于研究人员来说极为有用，因为你不再需要等2个多小时才能看实验结果了。
由于转子上的样品孔是旋转可移动的，因而离心式荧光检测系统可以固定激发光源和荧光检测器，随时检测旋转到跟前的样品管——由于每个样品管在检测时距离检测器和激发光源的距离都是“等价”一样的，使用的是同一个检测器和激发光源，有效减少不必要的系统误差。固定的结构使得仪器运行更稳定，使用寿命更长；离心式定量PCR都是逐个检测样品的，所以大多采用了长寿的LED（发光二极管）冷光源，运行前无须预热，无须校正；系统检测重复性也更好。
基于控温系统和光学系统的设计优势，离心式的定量PCR仪在参数上有着很多显著的优势。Corbett的Rotot-Gene3000标准型是真正独立的4通道（可建立新通道），4个独立LED激发光源（470nm/
530nm/585nm/625nm）保证zui少的光谱交叉 （<1 %）；PMT检测，6个检测滤光片，可检测荧光包括FAM/SYBR Green
I，TET，VIC/JOE，HEX，Max， NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas
Red,和Cy5，Cy5.5等等，机器的适用性非常宽，开放的试剂系统使得机器可适用Taqman探针、荧光染料SYBR Green
I检测、分子信标、FRET探针、Amplifluor探针等等（某些定量PCR仪只能适用Taqman法和荧光染料检测）；Rotot-Gene
3000灵敏度高，宽达12个数量级的线性范围，可正确区分1、2、3拷贝的基因，重复性极佳（R>0.99935）；由于转子在反应过程之中一直以恒定的低速旋转，使得样品间的温度均一性极佳（±0.01℃/秒），比Lightcycler还要高出一个数量级，各管温度条件完全相同，同一光学通路提供完全相同的测量通道，每标本每循环检测32次，满足高精度和一致性要求；Rotot-Gene3000提供了36
x0.2ml和72x0.1ml两种转子，检测是通过薄壁管侧壁而非管盖进行的，因而可以使用普通的0.2ml
PCR管，并允许在管盖上标记，这降低了使用成本；Rotot-Gene
3000的升降温速度低于LightCycler，但高于多数的固定加热模块的机型，能达到5℃/秒（管内实际升温速度达到2.5℃/秒）；Corbett还有一个光学变性——让待扩增样品预先进行一次熔解曲线程序，检测荧光染料信号大小的变化，找到代表全部双链DNA解链的峰值对应温度，在其后的反应中就无需总是将变性温度设为94度，也不需要延长孵育时间，这个使得反应时间大大缩短；对于大量样品的实验室，Corbett同时还提供定量PCR反应自动加样系统，不但可以和自家的Rotor-Gene配套使用提高工作效率和均一性、安全性，也可以配套其他的定量PCR仪，大大减少了科研人员的工作量。
3.第三类的荧光定量PCR仪以cepheid公司的Smartcycler为代表，其机型小巧，只有16个样品槽，独到之处在于这16个样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，也就是说这16个样品槽相当于16台独立的定量PCR仪！可以在同一定量PCR仪上分别进行不同条件的定量PCR反应。
在选购定量PCR仪之前我们需要先了解自己的需要——是同时检测大量样本？还是小规模的研究？是固定的标准化检测方法还是有机会尝试不同的方法？随着技术的加速发展不断有新的荧光素、标记方法和试剂盒面市，还要考虑仪器性能在将来的可拓展性等等。
