如何阅读基因载体图谱？（二）
二、选择和准备载体
选择载体主要依据构建的目的，同时还要考虑载体中应有合适的限制酶切位点等。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。选用哪种载体，还是要结合目的基因及载体特点以实验目的为准绳。
载体选择主要考虑下述3点：
1、构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
2、载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力—据克隆片段大小（大选大，小选小）。尤其对于病毒载体来说，载体包装容量的大小是评估能否成功包装病毒的首要因素。
①腺病毒可以插入长约8kb的外源基因。目前，我们包装过长度为7.5kb外源基因的腺病毒。
②慢病毒的包装容量约为6kb（包含载体带有的其他抗性基因或报告基因），但是2kb以上的外源基因包装慢病毒难度就增加了，增大1kb会下降1个单位数量级的滴度，故2kb以上的基因包装慢病毒需要进行评估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作为受体、转运蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包装可能会有一定难度。
③AAV的总包装容量是4.7 kb（包含载体中两个ITR约0.3kb +具体启动子 + 内含子约0.6kb + 具体荧光标签 + polyA约0.2kb），所以插入目的基因一般约2kb 左右。由于AAV包装容量有限，目的基因大于2kb，可考虑去除内含子，因为内含子只是有助于插入的目的基因稳定表达。
（2）确定表达蛋白的目的，然后再来选择优势的表达质粒。一般分为原核表达和真核表达质粒，前者主要用于体外纯化蛋白，如带His-tag的PET系列，带GST-Tag的PGEX系列，选用不同的表达载体，就得建立相应的纯化系统，包括缓冲液的配置、珠子/柱子的选择等等，还得考虑目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。这种原核纯化的蛋白一般用来制备单一的、需要量大的蛋白。真核表达载体一般是细胞、体内表达等需要时所用，只需要将它放到细胞或体内细胞即可，唯一考虑的是它的启动子的选择，常用都是cmv启动子的，表达效率较高，也有多种启动子经过改造的表达载体，一般用来表达需要调控表达时间及表达量的蛋白。
3、载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于连接，不产生阅读框架错位。
①选分子量小的质粒，即小载体（1-1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个；
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因。
选择载体还需注意：
无标签载体，起始/终止密码子都要添加！
标签在N端的载体，终止密码子要添加！
标签在C端的载体，起始密码子要添加！
（详细解读如下）
①对于无起始密码子和终止密码子的基因，插入无标签的载体要加入起始密码子和终止密码子。
②载体N端有标签，上游引物要对读码框；下游引物要加终止密码子(为了保证基因的表达,少翻译载体序列) 。
链接：对读码框是为了防止移码，是不是移码要看载体图谱，看酶切位点。从ATG开始，要保证三个碱基编码的氨基酸不能影响插入目的基因的正常编码，若影响了插入目的基因的正常编码就要在设计引物的时候在酶切位点前或者后插入一个或者两个碱基，总之是不能影响插入目的基因的正常编码蛋白。有的酶切位点含有起始密码子，如果标签在C端像Nco I就有一个ATG，这时候需要加碱基在酶切位点后面。
③载体C端有标签，上游引物要加起始密码子，且考虑是否加Kozak序列（真核表达系统）；下游引物要对读码框，并且要去掉基因本身的终止密码子（保证C端标签表达）。
链接：Kozak序列是位于真核生物mRNA 5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCGCCRCC（常见的序列是GCCACC），位于起始密码子（ATG）之前。它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始。在真核生物中，该序列相对比较保守。对应于原核生物的SD序列（原核基因在mRNA5’端起始密码子AUG上游一段对mRNA的翻译起作用的序列）。
添加Kozak序列的好处：核糖体需要Kozak序列进行稳定结合有助于提高真核基因的转录和翻译的效率。
