如何阅读基因载体图谱？（三）
三、改造载体
1、改造启动子：一般在过表达载体中CMV属于广谱型的强启动子，具体可根据实验需求，选用不同启动子，尤其是对于AAV载体构建时选用组织特异性启动子。
启动子名称 | 启动子大小 | 组织特异性 |
ALB | 2.4kb | 肝脏特异性 |
CAG | 944bp | 广泛表达的强启动子 |
CamKIIa | 1.2kb | 大脑皮层和海马神经元特异性启动子 |
CMV | 0.6kb | 广泛表达的强启动子 |
EF1A | 1.2kb | 广泛表达的启动子(尤其在体内稳定表达) |
GFAP | 1.0kb | 星形胶质细胞特异性启动子 |
aMHC | 0.4kb | 心肌α肌球蛋白重链启动子 |
cTNT | 702bp | 心肌特异性 |
Synapsin | 471bp | 成熟神经元特异性启动子 |
Rpe65 | 700bp | 视网膜特异性 |
3Xenhancer McK | 728bp | 小鼠中肌肉特异性启动子 |
NSE | 1.3kb | 神经元特异性烯醇化酶启动子 |
2、实验目的的需要：
①构建过表达or干扰载体
根据实验用途选择载体，如过表达载体通常选用CMV启动子，CMV因其集中了细胞转录因子结合位点而具有异常高的活性，是公认的真核表达中的增强子，一般插入某个基因的CDS区到CMV启动子下游，CMV负责启动该基因的表达，从而达到调高该基因表达的作用；而U6和H1更多的是用于shRNA的启动来达到敲低一个基因的作用，U6和H1启动子都是RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达约21个核苷酸和约50个核苷酸茎环结构（stem loop），RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，当RNA聚合酶Ⅲ到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止。
我们公司的shRNA病毒载体（包括腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体）是由U6或H1 启动shRNA 实现，并连接了报告基因，可以实时监测载体的转染效率。构建干扰载体针对目的基因（目的基因需要大于0.7kb，若小于0.7kb需要评估来确保能设计出8条shRNA序列），设计并提供4个针对靶基因的shRNA产品，确保4个shRNA中的1个产品在细胞感染效率达80%以上的前提下，在mRNA水平至少有70%的沉默效果；也可以按照客户的要求来设计，由客户确定shRNA 序列的长度，对于每条选定的靶序列，设计正义链和反义链，以 loop茎环结构相连，合成shRNA。
②是否携带GFP等荧光标签
携带荧光标签基本目的是为了观察感染目的细胞的效率；携带该标签的好处之一是不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达及定位情况，而且荧光性质稳定。但是，由于GFP标签比较大（约720bp），这种大标签在位置上对目的基因造成了空间位阻作用，对蛋白的空间结构产生一定影响，从而不利于目的基因蛋白本身的活性及正常功能的发挥。此外，还需要结合蛋白本身的特性，比如该蛋白为具有切割活性的蛋白，即使融合了GFP，标签很有可能会被破坏，终究会影响GFP的荧光及基本功能。一般不建议融合这么大的标签，实验需要带荧光标签，建议构建载体时通过P2A非融合。
③是否融合6×His、HA、Myc、FLAG等小标签
为了做免疫共沉淀实验或者WB检测蛋白表达,需要加融合小标签。多数情况下,由于多肽标签相对较小，对目的蛋白质结构影响小。但是在蛋白合成肽链的过程中，如果影响了蛋白的折叠，也会造成目的蛋白活性的下降甚至功能的丧失。
④是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
链接：启动子：促进DNA转录的DNA序列，这个DNA区域常在基因或操纵子编码区的上游，是DNA分子上可以与RNA聚合酶特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
增强子：为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序，其作用与其所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。
沉默子：负增强子，负调控序列。
核糖体结合位点/SD序列：mRNA的起始AUG上游约8~13核苷酸处，存在一段由4~9个核苷酸组成的共有序列，可被16SrRNA通过碱基互补精确识别的序列被称为核糖体结合位点/SD序列是对原核生物而言，在mRNA 5’ 端起始密码子AUG上游一段对mRNA的翻译
起作用的序列。
转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点下游有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
3、载体中P2A和IRES的选择：
IRES和P2A的比较 | ||
IRES | P2A | |
定义 | IRES内部核糖体进入位点序列：是一段约500bp的核酸序列，这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，能独立的起始蛋白翻译。 | P2A肽(2A peptide)是一种可"自我剪切"的短小肽链，最初在FMDV中发现，约22个氨基酸，2A肽可在蛋白翻译时通过核糖体跳跃从自身最后2个氨基酸C末端断裂。 |
优点 | IRES被放置于两个ORF之间的时候，可以同时表达这两个ORF。由于两个ORF分别有自己的起始密码子和终止密码子，所以会翻译两个独立的、没有经过修饰的蛋白。 | 两个基因（ORF）通过2A多肽链连接成为一个ORF，mRNA翻译成一个融合蛋白，但这两个融合蛋白会被识别2A的蛋白酶切成两个蛋白。这两个蛋白的摩尔比理论上是1:1。 |
缺点 | IRES的存在有时候会影响mRNA的结构，同时由于IRES和mRNA的5’CAP对核糖体/或翻译起始复合物的结合力不同，IRES后面的ORF翻译蛋白的水平有可能与IRES前面的ORF蛋白水平不一致。有的时候前面的ORF表达很好，但后面的ORF表达水平不高；有的时候后面的ORF和/或IRES会影响前面ORF的表达，甚至前面的ORF根本不表达。 | 2A是一个大约22个氨基酸的多肽。蛋白酶切割会发生在2A多肽C端的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之间。所以，前一个蛋白的尾巴上会留下一个20多个氨基酸的多肽。后面一个蛋白的N端会留下一个多余的脯氨酸。尤其是第一个蛋白，如果是一个小分子（比如分泌型的细胞因子），可能其功能会受到这20多个氨基酸的影响。 |
建议 | IRES序列后基因的表达效率显著低于IRES序列前基因的表达，所以与IRES相比，2A肽具有以下优点：（1）2A序列短，能够有效地实现连接基因之间的共表达；（2）位于2A下游的基因同样可以获得很高的表达水平。 |
四、影响载体选择的因素：
▪ 原核表达 or 真核表达
▪ 细胞实验 （过表达 or 干扰、瞬时表达 or稳转株、基因大小、荧光、药筛 ）
▪动物实验 （过表达 or 干扰、注射部位、基因大小、观察周期 ）
