Nanolive无标记显微镜在病毒感染活细胞的3D病变效应观...
Nanolive无标记显微镜在病毒感染活细胞的3D病变效应观察的应用
瑞士Nanolive公司开发的Nanolive 3D CX
显微镜采用三维全息断层扫描显微技术（DHTM），该技术发表于2013年自然光学期刊【Cotte et al., Nature
Photonics7 (2013) 113–17.】。Nanolive 3D
CX采集样本物理学折射率图像，实现定量无标记观察；采用1类激光光源，波长520nm，温和低功率0.2mW/mm2，相当于欧洲中部太阳辐射的五分之一，因而可对样本进行几乎无干扰的实时连续观察，克服了光毒性及光漂白影响的问题。
细胞病变效应（CPEs）是感染发生时的一种细胞学特征。因为光毒性的存在，当采用传统光学显微镜对细胞进行长期连续的观察时，难以客观评估细胞病变效应（CPEs）。苏黎世大学的格雷博小组通过数字全息断层扫描显微技术（DHTM），发现了病毒侵染活细胞时的不同模式。全息断层扫描显微技术（DHTM）观察样本时无需标记，简化样本处理流程；低能束激光通过透明样本时记录相位差，从而使得长期连续显微观察时光毒性的问题一并解决。该技术（DHTM）可测量折射率（RI），并计算折射率梯度（RIG），从而揭示细胞的光学异质性。通过研究，格博雷小组发现，痘苗病毒（VACV）、单纯疱疹病毒（HSV）和鼻病毒（RV）感染细胞可渐进性的增加折射率梯度（RIG），且三种感染的折射率梯度（RIG）的变化趋势与程度因病毒而不同。痘苗病毒感染，而非单纯疱疹病毒、鼻病毒感染，会导致细胞体积的振荡性收缩与膨胀。三种病毒感染均改变细胞膜动态，导致的凋亡特征类似于星形孢菌素的效果。作者指出，全息断层扫描显微技术（DHTM）作为定量无标记显微镜进行活细胞感染研究，在最小扰动的条件下揭示了具有病毒特异性的变化与细胞病变效应。
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折射率梯度(RIG)计算
折射率梯度(RIG)描述了三维立体空间中特定立体像素与相邻单元之间折射率(RI)的改变，如上图所示，中心深蓝色立体像素的折射率梯度(RIG)基于各维度相邻浅蓝色立体像素的折射率(RI)测算，计算公式如下：
折射率梯度(RIG)由Nanolive 3D CX 系统配套软件STEVE计算分析。
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细胞体积测量：
细胞体积测量由软件STEVE及Imaris完成。如上图A所示，为了衡量基于DHTM的体积测量的准确性，研究小组采用0.5um、0.75um、2um、4um的聚苯乙烯珠球进行了评估。聚苯乙烯珠球成像后的体积测算，采用两种不同的分析方法，Nanolive
3D CX
系统配套软件STEVE，是以像素为基础的方法；第三方三维图像分析软件Imaris，基于对象的的三维切面分割方法。如上图B所示，两种方法分析结果接近，Imaris分析更准确一点.
Nanolive 3D CX 连续观察动态视频
1，细胞形态与体积动态观察（灰阶图像）
无侵染发生HELA细胞，在长达8小时的连续观察中，细胞体积恒定。
而痘苗病毒（VACV）侵染的HELA细胞，细胞体积经历了振荡性的收缩与膨胀。链接视频1：痘苗病毒（VACV）侵染HELA细胞体积变化。
视频链接：https://v.youku.com/v_show/id_XNDYyMTg4OTgwOA==.html
2，药物处理抑制鼻病毒诱导的折射率增加（数字染色图像）。其中，细胞膜绿色标记，高折射率与高折射率梯度区域红色标记。
相对于无侵染HELA细胞，鼻病毒（RV）侵染HELA细胞为代表的折射率梯度（RIG）显著增加了2.5倍（视频链接2）；当研究小组使用抑制剂MLN9708(10uM)处理鼻病毒感染细胞时，可以明显挽救折射率梯度（RIG）增加的表型（视频链接3）。
视频链接2：鼻病毒（RV）侵染HELA细胞折射率梯度（RIG）变化
视频链接：https://v.youku.com/v_show/id_XNDYyMTg5MDI2OA==.html
视频链接3：鼻病毒（RV）侵染HELA细胞，MLN9708（10uM）处理后细胞折射率梯度（RIG）变化https://v.youku.com/v_show/id_XNDYyMTg5MDU2MA==.html
