志贺氏菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）使用说明
◆ 产品说明
致病菌检测系列基于独特的恒温荧光检测技术，可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于志贺氏菌的检测。检出限为103 CFU/ml。
◆ 产品组成（48测试）
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011041M |
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试剂 |
含量 |
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A-Shi-I |
1200μL × 1支 |
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B-I |
55μL × 1支 |
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C-I |
1200μL × 1支 |
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NG-I |
50μL × 2支 |
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PG-Shi-I |
50μL × 1支 |
◆ 适用仪器
Dhelix 1610、Dhelix 3210、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308c等恒温荧光检测仪， ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光PCR仪。
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；②灭菌0.2mL PCR管或八联管；③冰盒；④移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；⑤离心机；⑥涡旋混匀器；⑦金属浴
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：试剂准备区。
2）第二区：样本制备区。
3）第三区：模板添加区。
4）第四区：扩增及产物分析区。
★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
7. 检出限为103 CFU/ml是以1 ml 103 CFU/ml增菌液离心后收集菌体再提取的细菌基因组DNA作为模板。
◆ 样品处理
参照《GB 4789.5-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》中的5.1处理样品，对样品进行前增菌，制备的菌液保存待用。
以无菌操作取检样25 g（ml），加入装有灭菌225 ml志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000 rpm/min～10000 rpm/min均质；或加入装有225 ml志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1 min～2 min，液体样品振荡混匀即可。于41.5 ℃±1℃，厌氧培养16 h～20 h。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
将试剂完全解冻，各组分离心30s。
1. 试剂配制（试剂准备区，放置于冰盒中进行）：
若有N个待检样品，则参照下表，按照N+2个数量计算各组分用量（N个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照），将反应液置于0.6ml或者1.5ml离心管中，涡旋混匀，离心30秒，分装于0.2ml PCR管中，并向每管加入1滴C-I（约20μl）。
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试剂 |
使用量 |
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A-Shi-I |
22×(N+2)μL |
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B-I |
1×(N+2)μL |
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反应液总体积 |
23×(N+2)μL |
1. 模板制备（样本制备区）
建议使用试剂配套细菌组DNA提取系列产品，具体过程详见产品说明书。
2.添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）
在步骤1中已含有反应液的PCR管中加入2μL模板，顺序为NG-I、待测样品模板、PG-Shi-I。涡旋混匀30s，离心1min，立即进行扩增反应。
3.扩增反应（扩增及产物分析区）
①恒温仪器63℃条件下反应30 min。
②若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃ 15 s，63℃ 45 s作为一个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号，30个循环。
其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
◆ 结果判定
①仪器自动判定结果，若显示“阳性”，则样品中含有志贺氏菌；若显示“阴性”，则样品中不含有志贺氏菌或含量低于检测限。
②在荧光定量PCR仪上，根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线，则样品中含有志贺氏菌；若无“S”型扩增曲线，则样品中不含有志贺氏菌或含量低于检测限。
NG反应管结果显示“阴性”，PG反应管结果显示“阳性”，此次检测结果有效，否则无效。
