细胞的冻存与冻存细胞的复苏以及细胞的分化、衰老与...-1
为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异，有时因寄赠、交换和购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，最佳的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法 (－70℃~－196℃)的特点。细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。
一、细胞的冻存:
为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。
有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下：
◆包含10％甘油的完全培养基，
◆包含10％二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基，
◆50％ 细胞条件培养基和50％含有10％甘油的新鲜培养基，或
◆50％ 细胞条件培养基和50％含有10％二甲基亚砜的新鲜培养基。
对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是：
◆50％ 细胞条件无血清培养基和50％包含有7.5％二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基，或
◆包含有7.5％二甲基亚砜和10％细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。
1.悬浮细胞
●计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约 200～400g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
●以1×107到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5×107到1×107在无血清培养基中，再次悬浮细胞。
●分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入 4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。
●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃ 的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。
2.贴壁细胞
●使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。
●在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。
●以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
●以5×106到1×106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。
●分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入 4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。
●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃ 的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。
二、冻存细胞的复苏:
冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。
1.直接铺板方法
●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。
●直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。
●培养细胞 12到24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。
2.离心方法
●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。
●把1到 2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。
●以大约80x g离心2到3分钟。
●弃去上清。
●在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。
●细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。
