细菌耐药机理及其耐药细菌的检测与临床
全球面临主要耐药问题
? MRS(Methicilln-Resistant Stapylococci) 耐甲氧西林葡萄球菌包括MRSA，MRSE等。
? VIA(Vancomycin-Intermediate Staphyococcus Aurus) 万古霉素中介的金葡菌
? VRE(Vancomycin-Resitant Enterococci) 万古霉素耐药的肠球菌
? ESBL(Extended-Spectrum B-lactamse) 超广谱酶(大肠/肺克)
? Inducible Ampc (Ampc基因突变，高产量，50%左右三代头孢耐药) 阴沟、产气、聚团等肠杆菌属。
? Non-Fementatives(非发酵菌) 铜绿、不动、嗜麦芽
? PRP(Penicillin-Resistant S、P) 青霉素耐药的肺炎球菌。
耐药的主要机理
? .产生灭活酶 .靶位改变 低通性屏障作用(膜通透性下降及生物被膜) .主动外运
? .细胞缺乏自溶酶，对抗菌药物产生耐受性
对各类抗生素的主要耐药机制
? 抗菌药物 耐药机制
? β-内酰胺类 细胞壁通性降低，与PBPs亲和力与结合力降低，产B-内酰胺酶，自溶
? 氨基甙类 摄入减少，产钝化酶，核糖体30S亚基改变，EH下降和PH下降，降低氨基甙活性
? 大环内脂类 核糖体50S亚基改变，局部PH下降可降低活性
? 四环素类 药物外流加快，细菌体内积蓄减少，核糖体30S亚基 改变，产生灭活酶
? 氯霉素 摄入减少，产生氯霉素乙酰转移酶
? 林可类 核糖体50S亚基改变
? 万古霉素 不易产生耐药性
? 喹诺酮类 细胞外膜OMPF降低，摄入减少，膜传导通道改变胞内积蓄减少等
产生灭活酶是最多见的耐药机制，可通过细菌的基因突变引起，最主要是从其他细菌通过转化、转导，结合，异位而获得。最主要的灭活酶有二类：一类为?-内酰胺酶，另一类为氨基甙类钝化酶。
一、β-内酰胺酶：
? 主要分类方法有二种 a.分子生物学分类：根据末端氨基酸序列及编码基因位点(见图1)
? b.功能分类：根据酶等电点、水解底物、是否被酶抑制剂所抑制及分子结构类别（见表1表2）
表一 1998年Bush分类
? -内酰胺酶种类 克拉维酸、舒巴坦作用
? Group1：头孢菌素酶 （诱导酶） 不能抑制
? Group2a：青霉素酶 能抑制
? Group2b：广谱酶 能抑制
? Group2b’：超广谱酶 能抑制
? 金属酶： 不能抑制
超广谱? -内酰胺酶(Estended-spectrum ? -latamases,ESBLs)
ESBLs是质粒介导的，为TEM-1，TEM-2和SHV-1的突变酶，包括TEM-3到TEM-26，SHV-2SHV-6共近30种，与TEM-1，TEM-2和SHV-1相比，仅有1到4个氨基酸的不同，由在分子质粒编码的，质粒分子量大约在23Kbs到100Kbs之间，能够被棒酸所抑制，属于A类酶(分子生物学分类)，可以通过结合试验转给敏感菌，1983年，欧洲KnotheH在肺炎克雷转给敏感菌，1983年，欧洲KnotheH在肺炎克雷伯杆菌中发现了这种能灭活三代头孢菌素的SHV-1衍生物，现已在英国引起多次的医院感染爆发流行。
产ESBLs菌株的耐药特点：广谱酶（TEM-1，TEM-2，SHV-1）主要灭活青霉素和窄谱头孢菌素（一、二代头孢），三代头孢菌素对其稳定，而ESBLs能分解三代头孢（头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢曲松）以及单环酰胺类的氨曲能，但大多数产ESBLs菌株对复合三代头孢（如舒普深）敏感，几乎所有ESBLs菌株对泰能敏感。
产ESBL菌株的治疗
? 碳青霉烯类 首选药物
? β-内酰胺类 首选有效（必须给予相当高的剂量）
抗生素与β-内酰胺酶抑制剂 复合制剂
? 喹诺酮类 如果药敏结果显示敏感则可
氨基糖甙类 能有效 SMZco(复方新诺明)
产ESBL菌株的治疗
? 至今，有证据建议：经验治疗可能产ESBLs株导致的感染必须包括一个碳青霉烯类抗生素联合应用一个氨基糖甙类抗生素，直到细菌敏结果知道时。
根据临床药敏报告进行推测 对多种三代头孢菌素耐药的需考虑产ESBL有可能(现在有一种共识即若确定为产ESBL菌株，即使普通三代头孢及氨曲能药敏是敏感的也要报耐药)。
适用于治疗ESBL株的抗生素药 碳青霉烯类 复合三代头孢菌素(但需剂量大一点，注意Ampc基因)
阿米卡星(不同地区可不一致)
几种新的?-内酰胺酶
耐酶抑制剂广谱酶（IRT，IRBLs，18种）
水解氨苄西林、羧苄西林，对哌拉西林和头孢类仍敏感
克拉维酸、舒巴坦的抑制效果不好，舒巴坦对IRT最差
他唑巴坦仍有抑制作用 哌拉西林/他唑巴坦复方仍有活性作用
酶抑制剂:１克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦. ２.TEM型 三种均有抑制作用，作用相仿
３.SHV型 他唑巴坦、克拉维酸强于舒巴坦 ４.产酶细菌对酶抑制剂不敏感的原因
1）TEM-1产量过多 2）外膜蛋白改变 3）1型酶（AmpC）
4）1 2 型酶并存 5）2br（IRT） 6）2d（OXA-11）
TYPE β－Lac
概述:产生机制 染色体上的amp（通常处于被抑制状态） 突变 去阻遏活化编码产生AmpC酶
诱导机制 BPBs4，7a，7b（Sanders CC，1977）
近来还发现质粒介导的AmpC酶
来源：染色体上的AmpC转移到质粒，使ECO和KPN的临床分离株获得质粒介导的AmpC酶。
此外可见于：Salmonella spp ，P.Mirabilis.C.freundii。
染色体上的基因来自肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和假单胞菌属。
已报告17种，其中出现最多、分布最广的是CMY-2
特点: 往往在抗生素治疗过程中诱导产生，并有可能选择出持续、大量产酶的耐药菌株（去阻遏突变株）
? IMP是许多潜在的酶诱导剂之一，但没有选择去阻遏突变株的作用。
? 许多3-ceph是弱诱导剂，但有选择去阻遏突变株的作用。
临床意义:随着新型头孢菌素的使用增加，能产生type1 β-Lac，导致对β-内酰胺类多重耐药的菌株迅速出现并成为医院感染的重要病原菌。
? ICU和灼伤等重症患者对肠杆菌、沙雷菌和铜绿假单胞菌等能产生TYPE 1β-Lac的细菌高度易感，成为上述病区的严重问题。
? 只有严格控制三代头孢菌素的使用，才能控制这一严重问题。
治疗: 碳青霉烯类 四代头孢菌素：头孢吡肟、头孢匹罗
小结:１.AmpC酶（Bush1型酶）可引起GNB对三代头孢菌素和单酰胺类抗生素的耐药。对抑制剂不敏感，对IMP敏感。2.AmpC酶具有一定的诱导性3.AmpC酶不仅可由染色体且可由质粒介导。4.AmpC表达的调控机制未明，据认为与ampR、ampD、ampE、ampG有关。
氨基糖甙类钝化酶
1.氨基糖甙类抗生素对钝化酶稳定性不同，耐药率不同 2.庆大稳定性较差，耐药率高
3.阿米卡星、奈替米星稳定性高，耐药率低 4.尤其是奈替米星，对50%以上的庆大药株有效
? 氨基甙类钝化酶：磷酸转移酶、乙酰转移酶、核苷转移酶
氯霉素乙酰化酶;红霉素-O-磷酸化酶;克林霉素-O-核苷化酶.
二、靶位改变
(1)原有靶位的亲和力改变 PRP：PBP1a,2a,2b,2x的亲和力下降，造成对青霉素及头孢菌素耐药
(2)出现新的替代途径 8TKDa----PBP1---- 80 ----PBP2----PBP2a(PBP,278Kda)
75 ----PBP，3---- 70 ----PBP3---- 41 ----PBP4----
(3)任何抗菌药物均可由靶位改变产生耐药。
三、.低通透性屏障作用
(1)外膜通透性降低
a.孔蛋白(Porin)组成及数量改变有关大肠埃希菌OmpF和OmpC (耐药OmpF下降)
b.D2微孔蛋白(47KDa) [NextPage]
(2)生物被膜(Biofilm)的形成
a.BF组成：多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等
b.BF与细菌耐药 休眠状态，膜通透性下降； BF屏障作用 BF吸附灭活菌
BF吸附抗菌药物 BF使细菌获得足够时间，开启耐药基因
四、主动外运
操纵于MexA-MexB-OprM编号的三种蛋白组成的复合体。
MexA-40KD质膜蛋白(膜融合蛋白) MexB-108KD主动外运蛋白 OprM-50KD外膜蛋白
四、细菌耐药性的变迁
细菌耐药性随着时代的变迁，其中最重要的一个原因是抗药药物的滥用，筛选出耐药株，并增加细菌突变的压力。因此必须了解细菌耐药状况，选择合理抗菌药物进行治疗。
五、常见细菌耐药及治疗
(一)肺炎球菌(链球菌属的问题)
注意青霉素耐药问题(国内约5%)
（1）青霉素MIC测定
敏感 中介(低耐)用 耐药 .
MIC≤0.06mg/L 0.12∽1mg/L ≥2mg/L
(2)耐药机理: 未发现产B-内酰胺酶菌株 耐药是由于靶位改变即PBP2b,2x亲和力下降
(3)治疗 大剂量青霉素 高剂量阿莫西林 头孢噻肟 头孢曲松 万古(去甲万古) 利福平
(二)耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）
? 定 义：耐甲氧西林、耐苯唑西林且多重耐药的葡萄球菌。
? 耐药机理：MecA编码PBP2a及PBPs改变。
? 意义：对目前所有的β-内酰胺类耐药，通常对氨基甙类、大环内酯类、克林霉素和四环素多重耐药。
? 治疗：1.MRS轻度感染 利福平 ,SMZ- TMP,环丙沙星; 2.MRS严重全身感染 首选万古霉素
(三)、肠球菌
注意是否对庆大霉素高耐，是否耐万古霉素。
(1)庆大高耐：庆大MIC≥1000mg/L 万古耐药：万古MIC≥4mg/L
万古耐药方式：VanA(万古、替考拉宁R)， VanB (万古R，替考拉宁S)
(2)耐药机理： 庆大高耐：产APH (2，)－AAC (6，)氨基甙钝化酶耐万古：粘肽结构靶位改变(D－丙氨酰－D－丙氨酸被D－丙氨酰－D乳酸取代)
(3)治疗 基本治疗方式是青霉素或氨苄西林＋庆大霉素。
庆大高耐：需用万古或去甲万古，有时加用利福平。 万古耐药：目前尚无有效治疗方法。
VanA：非R，非氨基甙高R 青或氨苄＋庆大:青R，非氨基甙高R 头孢曲松＋庆大，环丙沙星＋庆大
VanB:非氨基甙高R 替考拉宁＋庆大霉素, 氨基甙高R 替考拉宁＋氟喹诺酮
多重耐药肠球菌 链阳菌素(Streptogramin)
注意事项：肠球菌对头孢菌素、氨基甙类、克林霉素和TMP/SMZ可在体外显示活性但临床无效。因此上述药物在此禁止使用。
(四)铜绿假单胞菌
膜通透性低，生物被膜，产生各种灭活酶及主动外排系统对许多抗菌药物自然耐药，仅下列药物可供选择： 哌拉西林、特美汀、他唑西林、头孢哌铜、舒普深、头孢他啶、氨曲能、泰能、 环丙沙星、氧氟沙星、奈替米星、阿米卡、妥布霉素。 可单用或联合应用上述药物。
从国内外耐药调查的资料看，对绿脓杆菌作用最强的是泰能与头孢他啶，且泰能与其它抗)铜绿假单胞菌药物间一般不会出现交叉耐药，是由于)铜绿假单胞菌对泰能的耐药主要是碳青霉烯类的特异通道(47KD的D2微孔蛋白)的关闭和金属酶的产生。
(五)大肠杆菌和肺克
产各种B－内酰胺酶比例几乎为100％，成对B－内酰胺抗生素不同程度耐药。
1)产青霉素酶：分解阿模西林或青霉素等，用复合青霉素等。
2)头孢菌素酶：主要分解的是一．二代头孢，一．二代头孢大多耐药，加酶抑制剂能逆转，三代头孢．头霉素敏感。
3)广谱酶(TEM－1，2，SHV－1)：分解青霉素类、二代头孢，能被酶抑制逆转
4)ESBL(超广谱酶)：能分解青霉素类、头孢菌素类及氨曲，一旦确定为产ESBL，青霉素类，头孢类及氨曲南均报耐药，主要出现在院内感染菌株。
2．再了解一下国外对三代头孢耐药的大肠与肺克的相关资料
CAZ-R的克雷伯菌菌血症的危险因素
特点 血中分离菌
CAZ-R（31）CAZ-S（31） P7
养老院住户 15 3 0．009
封闭导尿管 25 5 <0.00001
G+J管 14 1 0.0004
中心静脉插管 27 11 0.0001
事先用过抗生素 20 8 0.001
头孢他啶或胺曲南 11 0 0.009
CAZ-R克雷伯菌的交叉耐药
1990 1993
庆大/妥布 62% 73%
喹诺酮 39.8% 51.8%
在CAZ-S克雷伯菌 <5% <5%
这种高发的交叉耐药性是这种细菌难于治疗的原因之一。例如，在1993年，耐头孢他啶的克雷伯菌中，73%的菌株耐庆大霉素或妥布霉素，而超过半数的菌株耐喹诺酮类。相反，在对头孢他啶敏感的克雷伯菌中，同时两个药的耐药率都很低。
在72小时菌血症期间，在适当治疗和无适当治疗的带有头孢他啶耐药的病人的结局.很多情况下我们很难证实细菌的MIC值与所选用抗生不比疗效之间具有明确的关系。但是这项研究，此关系得到证实，因为在这些耐头孢他啶的菌症病人中，适当治疗的结局要比后来证实为不适治疗的结局好。在适当治疗病人中，18/19存活；相反，事后证实为不适当治疗即使用了三代头孢菌的病人中，5/12人死亡，2组间具有显著差异。适治疗组使用的亚胺培南联合或不联合氨基糖甙类。整篇文章证明，碳青霉烯类抗生素是治疗ESBL的最好药物。
四代头孢：头孢吡肟/头孢匹罗对I型酶高活性是由于：快速穿过外膜蛋白对I型酶稳定对PBP高亲和力但许多产ESBL的菌株耐四代头孢菌素，所以用它们治疗产ESBL株的感染是不安全的。
六、志贺菌属、沙门菌属
? 注意：不应报告选用一、二代头孢及氨基糖甙类，因为体外实验可表现有活性，但临床无效。
八、嗜麦芽窄食单孢菌
? 对泰能天然耐药，可供选择的有：SMZco,阿米卡星，特美丁，喹诺酮类。
九、不动杆菌
对一、二代头孢，半合成广谱青霉素，庆大霉素耐药率达70-80%，对三代头孢菌素可达50%，但这是条件致病菌，一般出现于院内感染，主要是三代头孢选择压力产生。治疗上至少选用复合三代头孢，但以泰能、阿米卡星、环丙沙星敏感率较高。
十、肠杆菌属细菌
主要包括阴沟、聚团、产气肠杆菌的菌种。
重要耐药G-菌产I型B-内酰胺酶（诱导酶）
? 100% 绿脓杆菌 100% 吲哚（+）变形杆菌 80% 肠杆菌属
? 80% 枸橼酸菌属 80% 沙雷菌属
肠杆菌属及其它肠杆菌科细菌
一 对氨苄西林耐药率55-94%，氨苄西林+舒巴坦耐药率为12.6-73%。肠杆菌科细菌对头孢唑啉耐药率为36-48%，但摩根菌属，枸橼酸菌属、普通变形杆菌耐药率高达80-100%,对头孢呋辛耐药率为30-50%,肠杆菌属、沙雷菌属、枸橼酸菌属几乎100%耐药，治疗上需选氨基糖甙类、碳青霉烯类（如：泰能）、氟喹诺酮等。
耐药的出现与头孢菌素、氨基糖甙类，亚胺培南和其他Beta-内酰胺类的治疗的关系：
抗生素治疗 治疗后耐药性的出现率n/N（%）
? 三代头孢 6/31（19）
? 氨基糖甙类 1/89（1）
? 亚胺培南 0/17（0）
? 其它 0/33（0）
这类菌株三代头孢菌素使用后出现耐药较高，而认为三代头孢不适当应用于肠杆菌属细菌的严重感染。
从细菌耐药情况可以得出如下结论
1. 多重耐药G+感染在增加，尤其是耐万古霉素菌株的出现和比例的上升是面临的严峻问题。
2.多重耐药G-正在医院，特别是危重病人增加，给临床治疗造成困难。
3.这种情况的出现主要是由于抗G-杆菌药物，尤其是三代头孢菌素及其它口服抗菌药物的滥用造成的。
4.多重耐药G+感染的最有效药物仍是万古霉素，多重耐药G-杆菌的最有效药物是碳青霉烯类。
