细菌耐药与临床对策（二）
1.2.2 DNA拓扑异构酶的改变引起喹诺酮类抗生素耐药
喹诺酮类药物的作用机制主要是通过抑制DNA拓扑异构酶而抑制DNA的合成，从而发挥抑菌和杀菌作用。细菌DNA拓扑异构酶有I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，喹诺酮类药物的主要作用靶位是拓扑异构酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ。拓扑异构酶Ⅱ又称DNA促旋酶，参与DNA超螺旋的形成，拓扑异构酶Ⅳ则参与细菌子代染色质分配到子代细菌中。革兰氏阴性菌中DNA促旋酶是喹诺酮类的第一靶位，而革兰氏阳性菌中拓扑异构酶Ⅳ是第一靶位。
当编码组成DNA促旋酶的A亚单位和B亚单位及组成拓扑异构酶Ⅳ的parC和parE亚单位中任一亚基的基因发生突变均可引起喹诺酮类的耐药性。在所有的突变型中，以gyrA的突变为主，占80％左右，其次是gyrB、parC和parE突变。在所有这些突变类型中，若Ⅱ型拓扑异构酶上存在2个突变点(如gyrA和parC上)，它们引起对氟喹诺酮类的耐药远远大于只有一个突变点(如gyrA或gyrB上)，前者是后者的3-4倍。同时没有发现突变仅出现在parC基因这一现象。这可能是因为DNA促旋酶是氟喹诺酮类的重要靶位,gyrA亚单位的改变可引起酶结构发生变化致空间位障，阻止喹诺酮类进入喹诺酮类作用区，或引起物理化学变化，干扰喹诺酮与酶的相互作用。这些结果显示gyrA上突变的出现是引起细菌对喹诺酮类发生耐药的主要机制，而parC突变只是进一步引起铜绿假单胞菌对喹诺酮的高度耐药。
DNA拓扑异构酶的改变是细菌耐喹诺酮类抗菌药的主要机制，其他耐喹诺酮类的机制还包括后面将要谈到的细菌膜通透性改变和主动外排机制。
1.3 细胞膜透性屏障和抗生素主动外排泵
细菌可以通过细胞壁的障碍或细胞膜通透性的改变，形成一道有效屏障，使得抗生素无法进入细胞内并达到作用靶位而发挥抗菌效能，这也是细菌在进化与繁殖过程中形成的一种防卫机制。这类耐药机制是非特异性的，主要见于革兰氏阴性菌。因为革兰氏阴性菌细胞壁粘肽层外面存在着类脂双层组成的外膜，外层为脂多糖，由紧密排列的碳氮分子组成，阻碍了疏水性抗菌药进入菌体内。另外细菌外膜上还存在着多种孔蛋白，分子较大者为OmpF，分子较小者为OmpC，它们可形成特异性通道(OprD)和非特异性的通道(OprF)，作为营养物质和亲水性抗菌药物的通道。抗菌药物分子越大，所带负电荷越多，疏水性越强，则不易通过细菌外膜。细菌发生突变失去某种特异孔蛋白后即可导致细菌耐药性,另外由于外膜蛋白OprF的缺失，使药物不易通过而产生耐药性。如铜绿假单胞菌特异性孔蛋白OprD2缺失即导致碳青霉烯类抗生素耐药。
另外一种导致细菌非特异性耐药的机制是细菌主动外排泵的存在，可以将进入细菌体内的药物泵出膜外，从而逃避抗生素的作用。主动外排系统由于能特异地将进入细胞内的多种抗菌药物主动泵出细胞外，导致细胞获得耐药性。如大肠埃希氏菌中的多药外排泵AcorAB-TolC系统可以导致细菌对包括四环素、氯霉素、红霉素、β—内酰胺类、利福平、氟喹诺酮类、氧化剂、有机溶剂、碱性染料等多种结构不相关的药物耐药。铜绿假单胞菌的MexAB-OprM系统的主动外排作用也是导致铜绿假单胞菌固有的多重耐药性的重要因素之一[8]。
细菌的膜耐药机制主要表现在铜绿假单胞菌的多药耐药性。铜绿假单胞菌几乎囊括了包括膜耐药在内的所有细菌耐药机制，其耐药已成为当前感染治疗中较为棘手的问题之一，尤其值得重视和研究[9]。
以上只是一些常见病原菌的耐药问题，这些耐药现象并非孤立存在的，临床上可能会遇到多种耐药菌或多种耐药机制并存的复杂感染问题。另外在临床实践中，随着感染病原菌的变化和变迁，新的细菌耐药问题也会不断涌现，如社区获得性感染中耐氨苄西林的流感嗜血杆菌的上升，院内感染中逐年增多的真菌耐药问题都有待进一步探讨。
2. 细菌耐药的临床对策
2.1 医务人员使用抗生素的基本要求
为了防止细菌耐药突变发生得过快，医务人员在使用抗生素时必须遵循：
①避免将抗生素用于单纯的咳嗽和感冒；
②避免用抗生素来治疗病毒感染，如病毒性咽炎；
③对于健康妇女的非复杂性膀胱炎，抗生素限制使用三天；
④限制使用电话开抗生素处方，特殊情况例外；
⑤窄谱抗生素可奏效的情况下不用广谱抗生素；
⑥抗生素处方应尽可能以细菌培养和药敏的结果为依据；
⑦在治疗过程中应根据需要修改抗菌治疗方案；
⑧外科预防性使用抗生素，要根据抗生素药理、药代的特点以及目标病原菌的不同，选用合适的抗生素，确定合理的给药时间和给药期间；
⑨使用抗生素治疗细菌感染时，要防止在细菌尚未完全清除的情况下过早的停用，亦要避免在没有督察的情况下长时间滥用；
⑩在选用抗生素时要考虑价格／效力比。
2.2 抗生素的使用要分一、二、三线
通常一线抗生素为常用的、价格较便宜的、已有一定使用时间的有效抗生素；三线抗生素常为新开发的抗生素，效果较好，价格通常亦较贵；一些效果好而副作用大的抗生素，通常也不放在第一线。NCCLS对于细菌药物敏感实验中的抗生素的选用，建议分为A、B、C三类，可作为一、二、三线药物选用的参考。临床上应首先选用一线药物，在一线药物不敏感或(使用72h)不奏效的情况下，才应考虑二、三线药物。要规劝和改变那些只喜欢用新药、贵药的不良习气。一个地区的抗生素的选用，要依据当地致病菌流行株的耐药特点，药物的药效特点，药物的价格以及供应情况等由专业人员进行研究确定。
2.3 细菌室要关注耐药菌的监测和耐药机制和检测细菌室要把细菌耐药问题作为重点工作之一。
要定期定期总结本院、本地的细菌药敏结果，广泛向医护人员宣传。发现新的耐药菌株，要认真核实结果，尽快向业内同道报告。要尽可能多地开展细菌耐药机制的检测，至少应开展：
①肠球菌和葡萄球菌的直接β—内酰胺酶检测；
②流感嗜血杆菌、淋病奈氏菌和卡他莫拉菌的直接β—内酰胺酶检测；
③肠杆菌科菌和非发酵菌的ESBLs；
④葡萄球菌的MRS检测。如能开展AmpC酶和金属酶的检测则更好。
要将耐药机制的检测结果写在细菌学报告上，并加强与医护人员的沟通，要求他们按细菌学结果正确使用抗生素。
2.4 实行策略性换药
当一种习惯使用的抗菌药物使用较长时间后，由于耐药菌的产生使得该药的临床效果明显降低时，可考虑在一段时间内停用该抗菌药，而换用另一种临床有效药物。其结果不仅临床上疗效提高，而且耐药菌株也会明显减少，包括对所替换的药物的耐药菌也会减少，这是目前国际上控制和预防耐药菌产生的一种有效方法。
2.5 关注抗菌药的PK/PD理论及其临床应用
近十多年来，人们在临床实践中发现许多口服抗菌药物按照NCCLS药敏试验的敏感、耐药分界点来判断药敏试验结果，常常与药代动力学、微生物学以及临床结果不符。这一发现引起—厂实验和临床抗感染专家的重视，他们努力探索，希望在药代动力学(Pharmacokinetics，PK)和药效动力学(Pharmacodynamics，PD)模型的基础上，将临床转归、致病菌是否清除以及药敏试验结果结合起来，以建立一个全新的方法来指导临床用药。
2.5.1 抗菌药的药效动力学参数
抗菌药药效动力学的研究范畴主要包括抗菌药的构效关系和量效关系，即抗菌药的化学结构与抗菌效果的关系以及抗菌药的浓度与抗菌效果的关系。抗菌药的作用机制和细菌的耐药机制是关注的热点。从抗感染治疗的角度考虑，量效关系对设计给药方案显得更加重要。
抗菌药量效关系的特点：主要通过抗菌药药效动力学参数来描述。抗菌药常用的药效动力学参数有：
2.5.1.1最小抑菌浓度(MIC)：
是抗菌药物对病原菌抗菌活性的主要定量参数，是引起细菌肉眼观察下未见生长的药物最低浓度。
2.5.1.2 最小杀菌浓度(MBC)：
是能使活细菌数量减少到起始数量的0.1％的药物最低浓度，陔指标亦作为描述药物抗菌活性的主要定量指标。
MIC和MBC反映的是抗菌药在体外的抗菌活性或抗菌潜能，但不能反映抗菌药在体内抗菌活性的时间过程，例如MBC不能提供抗菌药的杀菌速度，不能预言增加药物浓度是否可以提高杀菌速度；另一方面。MIC也有不足之处，它不能反映细菌在接触抗菌药物后，被抑制的状态能持续多长时间。
2.5.1.3 抗生素后效应(PAE)：
是指细菌暴露于抗菌药后，在洗去抗菌药的情况下，数量增加十倍(1logl0单位)所需的时间(与对照组的差)。PAE的大小反映抗生素作用后细菌再生长延迟相的长短，亦反映抗菌药作用于细菌后的持续抑制作用，故而又称持续效应(Persistent effects)。
PAE这个概念是1940年提出来的，当时仅用于青霉素的药效研究，至1970年才将此参数应用于其他抗菌药的研究。对于G+球菌，所有抗生素都有PAE；对于G—菌，干扰蛋白和核酸合成的抗菌药都有延长的PAE，这些抗生素包括氨基甙类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、利福平等。短PAE或无PAE见于β—内酰胺类对G—菌，例外的是碳青霉烯类，它们对铜绿假单胞菌的PAE延长。
PAE在体内是变化的，动物感染模型的研究发现：
①体外PAE不能预见体内的PAE，多数情况下，体内的PAE长于体外PAE，在白细胞存在时，氨基甙类和喹诺酮类的PAE将更长；
②体外β—内酰胺类对链球菌的PAE延长，而体内未见延长；
③体外在长给药间隔或重复给药后氨基甙类的PAE降低或消失，但体内实验未发现此结果。
2.5.1.4 亚抑菌浓度下的抗生素后效应(PA SME)：
是指细菌暴露于高浓度(10×MIC)抗菌药后，在低于MIC的药物浓度下，数量增加十倍(1log10单位)所需的时间(与对照组的差)。PA SME的意义与PAE相似，不同的是将细菌暴露于高浓度抗菌药后，继续置于低药物浓度(<MIC)下，观察其再生长的延迟相。PA SME较之PAE更符合体内情况，因为药物进入机体后，对于敏感菌而言，总是药物浓度先在MIC以上，然后随着药物清除，药物浓度逐渐降低至MIC以下。
2.5.1.5 抗菌素后白细胞活性增强效应(Postantibiotic Leukocyte enhancement,PALE)：
在一些抗菌药物的作用后，白细胞吞噬活性或胞内杀菌作用表现出明显的增强，这可以看作是另一种形式的抗生素后效应，表型是PAE延长(体内和体外)。阿奇霉素的PALE较强，这是它不同于其他大环内酯类抗生素的一个重要原因，产生较长PAEs的抗菌药倾向于显示最大的PALE。氨基甙类和喹诺酮类在白细胞存在时，通常可使PAE延长一倍(对于G-菌)，但白细胞对PAE小的抗生素，如β—内酰胺类未见有明显的增强效果。
2.5.1.6 杀菌曲线(Time-Kill curves)：
将不同浓度(如1／2、l、4、16、64MIC)的抗菌药物加入菌液中，于不同时间取菌药混合物作菌落计数，绘制时间——菌浓度曲线，即杀菌曲线。
2.5.2 抗菌药的主要药效学参数与抗菌药的分类
不同的抗菌药物其抗菌活性的时间过程是不一样的：
①β—内酰胺类药物对金黄色葡萄球菌在体内可见PAE延长，但高浓度的杀菌效果并不高于低浓度(从杀菌曲线上看，不同浓度的杀菌曲线无明显差别)，并且药物浓度低于MIC时，金黄色葡萄球菌将很快复苏生长，即PA SME亦不明显，因此剂量效应主要决定于药物浓度在MIC以上时细菌的暴露时间，即Time>MIC是主要参数；
②相反，氨基甙类和喹诺酮类药物，给予高浓度时，杀菌效果增强(从杀菌曲线上看，不同浓度的杀菌曲线分离，即相差较大)，杀菌时间缩短，PAE延长，细菌暴露于高浓度后在低于MIC浓度下生长较慢(PA SME延长)，欲提高疗效在于加大给药浓度，因此，峰浓度与MIC的比值(Peak／MIC)或24小时药时曲线下的面积与MIC的比值(AUC／MIC)是主要参数。
根据上述原理，Shah等将抗菌药分成两个基本的杀菌活性模式，或称作为两个群：第一群为浓度依赖的杀菌剂，如氨基甙类、喹诺酮类、甲硝唑类和阿奇霉类等；第二群为时间依赖的杀菌剂，杀菌率在低倍MIC时即已饱和(通常4-5×MIC)，在此浓度以上杀菌速度及强度不再增加，主要参数为Time>MIC，如β-内酰胺类、大环内酯类(除外阿奇霉素)、克林霉素等。
2.5.3 PK／PD参数的大小与疗效
2.5.3.1 对于时间依赖的杀菌剂(如β—内酰胺类)，主要PK／PD参数为Time>MIC(或Time／MIC)，通常取血清浓度超过MIC的时间为40％-50％的给药间隔，即Time above MIC为40％-50％时，治疗率可达90％-100％。
2.5.3.2 对于氟喹诺酮类抗菌药，24小时AUC／MIC是主要PK／PD参数，临床达到制菌效果的AUC／MIC值是~35，即平均每小时的AUC／MIC应为~1.5(1.5×24=36)，此值不依赖给药间隔。以G+／和G-菌感染小鼠、大鼠和豚鼠，以氟喹诺酮进行治疗，当24小时AUC／MIC值<30时，动物死亡率>50％，当AUVC／MIC≥100时，则动物无一死亡。我们似乎可以得出如下结论：为了使各种实验感染的动物获得100％的保护(100％存活)，氟喹诺酮药物的血清浓度需要在每小时内均达到4倍MIC的水平，即24小时AUC／MIC达96(4×24=96)。
2.5.3.3 对于氨基甙类药物，动物感染模型的治疗研究显示：24h AUC／MIC比值较之peak／MIC值与临床相关更好。但在临床研究中，却与上述结果相反，peak／MIC值是主要PK／PD参数，与临床相关较之AUC／MIC为好。为了获得≥90％的临床有效率，peak／MIC需达到8～10。与氟喹诺酮药物相似，当氨基甙类药物的peak／MIC值为8-10时，亦可减少耐药菌的发生率。为了提高峰浓度，氨基甙类药物近年来多主张每天给药一次。
根据抗菌药的PK／PD理沦，我们可以通过计算来确定细菌药物敏感实验的敏感耐药分界点，对患者进行个性化的成功给药和治疗，有效地防止耐药菌的发生(篇幅已太长，恕我不能赘述，请思考)，真正实现抗感染的3S原则(Right time,Right patients,Right antibiotic)。
参考文献
1．李卫光，王一兵，王炜等．老年下呼吸道感染病原茵及其耐药性分析[J]．中华医院感染学杂志[J]．2003,13(8)：784-786
2．郭胜祥，胡继红，缪竞智，等．老年下呼吸道感染患者痰病原茵及其β内酰胺酶阳性株分析[J]．中华老年医学杂志，2000，19(4)：254 257
3．Patricia
A.B.,Extended-Spectrum-Lactamases in the 21st
Century：Characterization,Epidemiology,and Detection of This Important
Resistance Threat[J],Chinical Microbiology Reviews,2001,14(4)：933-951
4．卢小军，吴升，张丽君等．产超广谱β—内酰胺酶菌在老年患者中的感染[J]．中华医院感染学杂志，2003，13(6)：586-587
5．张艳桃．老年院内肺炎中非发酵茵群感染的临床研究[J].中华医院感染学杂志，1998，8(1)：12—13
6．张东，高德伟，邹林．老年呼吸监护病房耐甲氧西林葡萄球菌流行的控制[J]．中华医院感染学杂志，2003，13(2)：174—176
7．Hamsman D,Bullen MM．A resistant pneumococcus [J],Lancet，1967,2：264—265．
8．张印俊．病原菌对抗菌药物的耐药机制[J]．国外医药抗生素分册，2002，23(5)：206—215
9．褚海青，李惠萍，何国钧，等．铜绿假单胞茵的耐药机制[J]，中国抗感染化疗杂志，2003，3(1)：45-47
10.
Craig WA.Pharmacokinetics/Pharmacodynamics Parameters：Rationale for
Antibacterial Dosing of Mice and Men [J].CID,1998,26：1~12
11. Jacobs
MR, Bajaksouzian S,Zilles A,et al. Susceptibilitis of Streptococcus
pneumoniae and Haemophilus influenzae to Oral Antimicrobial Agents Based
on Pharmacodynamic Parameters：1997U.S. Surveillance Study {J}.
Antimicrob.Agents Chemother.,1999,43(8)：1901~1908
12. Vogelman B,Craig WA.Kinetics of Antimcirobial Activity[J]. The Journal of Pediatrics,1986,108(5-2)：835~840
13.Odenholt-Tornqvist
I,Lowdin E and Cars O.Postantbiotic Sub-MIC Effects
Vancomycin,Roxithromycin,Sparfloxacin,and Amikacin[J]. Antimicrob.
Agents Chemother.,1992,36(9)：1852~1858
14 . Jacobs MR.Pharmacodynamic Breakpoints：New Concepts for Old Problems.ISAAR2001：178-186
