同步辐射技术助力MALDI质谱基质电离的作用机制分析
A． 抗生素检测
在全球范围内，人们越来越担忧抗生素的不当使用不仅会污染环境，还导致食品受到污染，甚至威胁到公共卫生的医疗实践。由于抗生素的过量使用，各种“超级细菌”相继出现，已经成为人类健康的致命威胁。因此需要开发更快速且灵敏的技术来检测微量的各种抗生素来满足不断增长的需求。传统检测方法包括微生物生长抑制试验，色谱法，免疫化学检测，以及基于受体或酶的试验。但是，这些方法仍存在着一些缺陷，如低灵敏度、样品预处理步骤复杂、受酶活性波动影响等缺点。
B． MALDI-TOF-MS技术优势和缺陷
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是分析生物分子不可或缺的工具，具有高灵敏度、高通量和快速的优点。然而，在MALDI-TOF MS中广泛使用的传统有机基质（CHCA，DHB，SA等）由于在激光照射下自身产生许多结构碎片，使其在质荷比低于700时具有强烈的背景噪声。这些背景噪声抑制了小分子分析物的信号，因此严重限制了MALDI-TOF MS在m / z<700分子范围内的应用。
C． 研究的出发点
在最近的研究报道中，各种无机纳米材料或无机纳米结构表面已经被提出作为合适的基质应用在MALDI里替代有机基质，包括硅，金属，金属氧化物和碳基纳米材料。在选择无机纳米材料做基质时，较大的比表面积、良好的光吸收能力和电子转移能力是重要的参考条件。本文作者曾报道过，CuCoO-GO材料具有很好的光电性能，在氨硼氮水解过程中提高了电子转移能力从而起到协同催化作用。而此前氧化石墨烯（GO）也被报道其本身有较大的表面积和良好的光吸收性，具有做基质的潜力。因此，本文作者（苏州大学FUNSOM研究院刘坚教授课题组和钟俊教授课题组）就想到把CuCoO-GO复合材料应用到MALDI中做基质，希望能利用这些特性协同促进MALDI中小分子的电离能力从而提高质谱信号。
另一方面，将无机纳米材料作为MALDI基质虽然在文献上已有不少的报道，但是对于这类材料是如何促进目标分析物解吸附电离的机制并不清楚。本文作者希望能够充分利用同步辐射技术追踪材料组成元素价态变化的能力，研究MALDI基质在辅助增强分析物激光解析电离过程中的机理，探究其基质与目标分子的相互作用以及所伴随的电荷偏移过程。通过原位实验了解CuCoO-GO与分析物在激光照射前后价态的变化，在原子层面推测其相互作用的信息，探究增强其效率的影响因素。首次利用同步辐射技术尝试对MALDI质谱基质增强分析物解析电离的作用机制进行解释是该工作的亮点。
材料的表征与质谱性能
CuCoO-GO用SEM，TEM，AFM，XRD，Raman等做了表征，主要证明了CuCoO-GO的尺寸大小和厚度以及材料的均一性(Fig. 1)。
Fig. 1 Characterization of CuCoO-GO (CuO-GO and GO as the control samples. (a) TEM image； (a1) Dark-field TEM image； (a2) Zoomed-in view of dark-field in the red box； (a3-a4) Corresponding elemental mapping in the red box: Cu (green) and Co (brown). Sample: CuCoO-GO； scale bars as specified. (b) AFM image of CuCoO-Go in the larger field of view； (b1) AFM of a single nanosheet of CuCoO-Go； (b2) Height profile correspondingly along the blue line of (b1). scale bars: 5 µm. (c-d) Raman spectra and X-ray diffraction (XRD) patterns of GO, CuO-GO and CuCoO-GO.
在探究CuCoO-GO的质谱性能时，本文作者在相同的仪器条件下，比较了CuCoO-GO基质与传统的有机基质CHCA和SA的背景噪声。如Fig. 2a所示，有机基质（CHCA或SA）在低分子量范围（m / z<700）内产生强烈的背景噪声。相比之下，CuCoO-GO的背景很干净，这证明了CuCoO-GO作为MALDI基质检测m / z <700范围内的小分子具有良好的潜力。接着本文作者选择小分子抗生素磺胺嘧啶（SDZ）和磺胺甲恶唑（SMX）为分析物，分别在正离子和负离子模式下进行MALDI 质谱检测。如图2b所示，在任何一种模式中，分析物都有明显的特征峰和较高的信噪比。本文作者通过实验证明该方法的检测极限可达ug/L级别，比之前文献报道值低几百倍。同时，本文作者用同位素标记的方法对磺胺嘧啶进行了定量检测，定量结果表明，无论在水中或牛奶溶液中都具有良好的线性关系，表明该方法可应用于牛奶样品中残留抗生素定量分析。
Fig. 2 High performance of CuCoO-GO matrix in MALDI mass spectrometry for antibiotic analysis. (a) The background noise of CuCoO-GO matrix in comparison with traditional organic matrices of CHCA and SA, in the negative-ion mode. (b) The mass spectra of SDZ and SMX in the positive-ion and negative-ion modes using CuCoO-GO matrix. (c) Mass spectra of SDZ and sulfapyridine-13C (internal standard) in the water solution or the milk sample, and the calibration curves for absolute quantitation of SDZ in the negative-ion mode (n=4). Error bar: standard deviation.
基于磺胺嘧啶分子的高灵敏定量检测，本文作者进一步将CuCoO-GO基质应用于抗菌药物耐药性分析上。通过MALDI质谱同位素标记的方法定量分析大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在与磺胺嘧啶共孵育后的细菌外部和内部的药物浓度，可为研究细菌耐药机制提供重要的线索。
MALDI质谱的机理解释
本文作者利用同步辐射技术进行原位表征，探究CuCoO-GO基质在有无小分子分析物时的特定元素吸收变化。如下图所示，CuO-GO在添加了分析物前后与没有发生明显的变化，而CuCoO-GO在添加了检测物后Cu原子的 L-edge吸收峰位发生了右移。这种变化可归因于SDZ与Cu元素之间的相互作用，其诱导SDZ中部分电子从Cu转移到O的效应。在原位Cu K-edge 吸收测量实验中，也得到支持上诉结果的实验数据，并进一步研究了UV光照射前后对CuCoO-GO/检测物体系的Cu K-edge 吸收变化的影响。
Fig. 5 Investigation of the interactions between the SDZ and CuCoO-GO by synchrotron radiation-based techniques.
基于上述实验证据，本文作者提出了一种基于CuCoO-GO基质的小分子电离机理（见示意图）。CuCoO-GO复合纳米材料能够在GO纳米片层上形成的Cu，Co，O原子团簇辅助高效电离小分子分析物（SDZ）。 SDZ分子可以通过氢键和范德华力等在CuCoO-GO的表面上发生较强的吸附。基质上的Cu和O原子有可能分别与SDZ分子中的S = O键和-NH-基团有相互作用。Co作为基质中原子团簇的掺杂元素（虽然很少量）使其整体与GO之间的相互作用增强，促进CuCoO-GO杂化基质与SDZ在电离过程中的电荷转移。通过激光可以为SDZ的去质子化（SDZ-H) -提供必要的能量，并且被MALTI-TOF MS中的质量分析器检测。杂化CuCoO-GO纳米片层材料由于其离域π电子系统能够促进该去质子化过程。由于Co和Cu双金属氧化物在GO纳米片层上的协同效应，该复合材料基质可以提高小分子的电离效率，从而提高它们在质谱中的信噪比。
Fig. 6 Schematic diagram of the mechanism of SDZ ionization using CuCoO-GO matrix for MALDI TOF mass spectrometry.
结论
本文开发了一种复合纳米材料CuCoO-GO作为新型的MALDI基质，并揭示了分析物与纳米材料相互作用的电离机理。与文献报道相比，CuCoO-GO基质可以检测各种抗生素，且检测极限改善数百倍。与此同时，该方法重复性好，并且能有效定量分析牛奶样品中磺胺类药物的量。此外，本文开发的方法可以提供抗菌药物的细菌内外浓度的定量分析，以及常规AST方法难以获得的潜在代谢物；并期望CuCoO-GO基质能够灵敏地检测含有羧基，胺，酰胺，羰基，磺酸基和羟基等官能团的各种生物分子。通过利用同步辐射技术，本文作者研究了磺胺嘧啶分子与CuCoO-GO基质之间的相互作用的电离机理，这种对基质/分子相互作用和电离机制的关键理解可能为新基质的开发和小分子的超灵敏检测增加创造性的知识。
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