流式细胞仪免疫磁珠亲和板结合分离法分选c kit+肝癌细胞
肿瘤干细胞研究需要获取高纯度、高活力、高增殖能力的肿瘤亚群细胞，并尽量避免混杂细胞、低活力、低增殖能力细胞对细胞亚群特性的干扰。笔者在前期研究的基础上，比较了流式细胞仪分选（flow cytometry sorting，FCMS）、免疫磁珠分选（magnetic cell sorting，MACS）及亲和板结合分离法（immune panning isolation）3种方法分选c kit+肝癌细胞的效果，以期找到一种分离肝癌亚群细胞的较佳方法，为肿瘤干细胞的研究奠定基础。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本：取材于南方医科大学附属珠江医院2006年4月经手术切除的肝癌标本，经病理证实为原发性肝细胞癌。患者术前未进行任何抗肿瘤治疗，手术后患者4周内存活。
1.1.2 实验动物：裸小鼠（BALB/c）75只，雌雄兼用，3～5周龄，质量10～20g，由南方医科大学动物实验中心提供。
1.1.3 主要试剂：低糖、胰蛋白酶、无钙镁离子的平衡盐溶液（D Hank'S液，pH7.2～7.4）、细胞增殖试剂CCK 8购自美国Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司；兔抗人c kit多克隆抗体、FITC标记的羊抗兔IgG（1∶200）购自丹麦Santa Cruz公司；抗兔IgG1免疫磁珠购自德国Miltenyi Biotech公司；其他常用试剂为国产分析纯。
1.1.4 主要仪器：免疫磁珠分选磁力架、MS磁性分离柱购自德国Miltenyi Biotec公司；Epics Altra型流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司；各种常用耗材购自广州威佳科技公司。
1.2 方法
1.2.1 分离、培养肝癌细胞：参考文献方法，分离、纯化肝癌细胞，常规培养及传代。
1.2.2 c kit+肝癌细胞的分选：对数生长期的第8次传代细胞的单细胞悬液，分别以下述3种方法分选c kit+细胞：(1)流式细胞仪分选：按流式细胞仪分选的要求，以兔抗人c kit多克隆抗体为一抗，FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，标记细胞后上机分选，获取c kit-细胞和c kit+细胞。(2)免疫磁珠分选：参考文献方法，以兔抗人c kit多克隆抗体和抗兔IgG1免疫磁珠，严格按照免疫磁珠分选操作规则获取c kit-细胞和c kit+细胞。(3)亲和板结合分离法分选肿瘤细胞：按文献中亲和板结合分离法，以兔抗人c kit多克隆抗体为一抗，FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，分选c kit-细胞和c kit+细胞。每种方法分选出5组细胞，进行如下检测。
(1)细胞活力检测：采用台盼蓝排斥实验检测细胞活力并计算细胞存活率=［活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）］×100%。
(2)细胞增殖能力试验：参照文献的CCK 8法检测并计算细胞刺激指数（stimulate Index，SI），SI=（实验孔OD值-空白孔OD值）/（阴性对照孔OD值-空白孔OD值）。
(3)c kit+肝癌细胞的纯度：按流式细胞仪检测的要求，以兔抗人c kit多克隆抗体为一抗，FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，各组细胞标记后上机检测c kit+肝癌细胞的纯度。计算分选前、后c kit+细胞的百分比。
(4)计算细胞回收率：计算分选前后的细胞数，求出3种方法分选后的得率。
(5)c kit+亚群肝癌细胞成瘤能力测定：参考文献方法，每个样本接种5只裸鼠，检测3周内生成移植肿瘤的比例。
1.3 统计学分析
所有数据采用SPSS 11.5软件分析。多组比较采用One Way ANOVA检验及LSD两两比较，两组之间比较采用独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
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标准
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