束缚应激所致小鼠脑区的神经递质和行为改变及运动干...
束缚应激所致小鼠脑区的神经递质和行为改变及运动干预效果
摘要：为了探讨束缚应激对小鼠神经递质、行为的影响及有氧运动的干预效果。选用 1 月龄 C57BL/6 小鼠 80 只，随机分为 4 组：控制组(Control，n=20 只)、束缚应激组(Stress，n=20 只)、运动组(Ex，n=20 只)、运动束缚应激组(Stress+Ex，n=20 只)。控制组安静饲养，束缚应激组进行2 周的束缚应激，运动组每天进行 2 h 跑台锻炼，运动束缚应激组同时进行束缚应激和跑台锻炼。结果发现：行为试验中，束缚应激组小鼠社交行为显著下降、焦虑及抑郁行为水平发生显著上升(P<0.05)，而运动干预能够缓解束缚应激对这些行为的影响。生化指标同样说明有氧锻炼有效缓解了束缚应激导致的行为和单胺类神经递质的改变。结果说明：束缚应激会导致社交及情绪相关行为的改变，而运动干预会起到有效的缓解作用。
关键词：运动生理学；束缚应激；运动；社交行为；单受神经递质；小鼠
持续压力会造成人或者动物改变社交习惯、降低认知能力，甚至产生抑郁或者焦虑等情绪失调。因此，探索压力应激对个体脑及行为塑造作用机制对保障人类身心健康具有重要意义。束缚应激是广泛使用的模拟人类生活压力应激的动物模型之一。束缚应激会影响动物的多种行为学和生物学指标，其中包括对学习和记忆等认知方面的损害、社交互动行为的改变。急性束缚应激会使机体产生负性情绪，造成脑部的海马神经元损伤，树突棘和增生物增加。慢性束缚应激因改变 HPA 轴的敏感性而造成行为的改变。大量研究发现，伴随着大脑皮层、海马及外周血中儿茶酚胺神经递质及代谢物含量的改变，慢性束缚应激会显著降低实验动物的认知功能。束缚应激会造成神经内分泌改变，包括儿茶酚胺的降低及皮质酮应激反应敏感性下降。这种神经内分泌的改变与神经元中五羟色胺受体功能和表达的上升及五羟色胺神经递质分泌的改变相关。慢性应激会使杏仁核中的神经元极度活跃，造成相对应神经元的损伤。而动物研究表明，运动可调节多种神经递质系统，如五羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)及它们的代谢产物，进而会起到积极的干预作用。
虽然束缚应激对神经递质及行为影响的研究多见报道，但是运动对慢性束缚应激干预效应和机制研究相对较少。因此，本研究用小鼠慢性束缚应激模型考察运动干预效果，探索其作用机制。
1 实验材料和方法
1.1 试剂与仪器
1)去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)购自美国 Sigma 公司，纯度≥ 98.0％；乙腈：色谱纯，采用美国 Fisher Scientific 公司产品；高氯酸、碳酸氢钾、冰醋酸等均为分析纯，南京化学试剂有限公司产品；实验用水为自制二次重蒸水。
2)LC.10AD vp 高效液相色谱仪、SPD-10AD vp 荧光检测器、色谱柱为岛津 Shim-pack VP-ODS 的 CTs液相色谱柱(150 ibm×4.6 mm×5 μm)(日本岛津公司)；GL.88B 旋涡混合器(江苏海门麒麟医用仪器厂)；电恒温水浴装置(江苏光都机电设备有限公司)；Supermaze动物行为分析系统、社交行为箱、高架十字迷宫、新物体识别箱、强迫游泳实验箱(上海欣软公司)。
1.2 实验动物和实验设计
C57BL/6 小鼠(3 周龄)购于北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠养在通风的隔笼里，室温为 20~25 ℃，相对湿度 60% ，光暗周期为 12 h，保持安静，食物和水按时提供。在正式实验前所有小鼠均预先适应 1 周并且每天都进行小鼠称重。80 只小鼠随机分成4 组，每组 20 只，控制组(n=20 只)，束缚应激组(n=20只)，运动组(n=20 只)，运动束缚应激组(n=20 只)。具体实施方案如下：适应性喂养 1 周，束缚应激为每天上午 10：00 开始持续 120 min，跑台锻炼时间为下午18:00 持续 30 min，每周训练 5 d，共 2 周。束缚应激方法：取 50 m L 圆柱形离心管(管底留一个 3 mm 半径小孔)，将小鼠放在只能容纳小鼠整个躯体的管子中，将管子放在同一房间的不同笼子中，放置时间是上午09：00—11：00。跑台锻炼方法：进行平坡的跑台运动，速度 0.8 km/h，坡度为 0°，实验开始前 1 天下午18：00 对小鼠进行一次 15 min 的适应性训练，然后第2 天按上述运动方案训练。其中运动束缚应激组同时进行束缚应激和运动干预；束缚应激组只束缚应激；运动组只运动干预；控制组与其它组小鼠一起饲养，无运动干预和束缚应激。所有动物实验均遵循东南大学伦理委员会指导文件操作。
1.3 指标检测
1 月龄小鼠正处于青少年期，为了研究是否束缚应激会导致焦虑、抑郁以及社交行为的改变。在两周实验完成后，依次进行社交行为实验，高架十字迷宫、新奇-抑制摄食试验以及强迫游泳实验来验证小鼠的焦虑和抑郁水平及运动干预对小鼠这些行为的影响，行为实验结束后，平衡 24 h 后处死并迅速检测不同脑区单胺类神经递质水平。
1)社交行为实验。
社交行为实验采用包含有3个相同大小的房间(40 cm×40 cm×20 cm)的社交行为观察室，中间为空房间并有通向两侧房间的通道，两侧房间分别各放 1 个鼠笼。实验小鼠分两类，一类为社交行为专用陌生小鼠(stranger)，而另一类为实验鼠。测试选用 2 只社交行为专用陌生小鼠 1 和 2，均为雄性，年龄、体重相近，同实验小鼠品系相同且实验前没有接触过的小鼠。 用不透明的树脂玻璃板隔离左右侧两个房间。实验开始前将实验鼠放入行为观察箱的中间房间适应 5 min，期间将陌生小鼠随机放入一侧房间的鼠笼中。实验小鼠可以同陌生小鼠隔着鼠笼相互嗅探，但无法进行肢体接触。正式实验开始时移去隔离板，通过动物行为分析系统分别记录10 min内实验小鼠同空鼠笼或陌生小鼠的互动时间和房间逗留时间。互动时间=实验小鼠直接接触鼠笼+距 2 cm 内直立嗅探的时间。实验小鼠在每个房间的逗留时间以每只小鼠头和四肢均进入房间后为准。实验结束后将实验小鼠取出、归笼。每次实验后用体积分数为 70%酒精清洁整个测试装置以备下一个实验。具体过程见图 1。
如图 1 所示，笼中的为陌生小鼠，笼外的为实验小鼠，社交行为实验前后包括两个阶段：第 1 阶段同时记录(A)实验小鼠在陌生小鼠 1 或空鼠笼所在房间的逗留时间和(B)实验小鼠同空鼠笼或陌生小鼠 1 互动的时间；第 2 阶段为(C)实验小鼠在陌生小鼠 1 或陌生小鼠 2 所在房间的逗留时间和(D)实验小鼠同陌生小鼠 1及陌生小鼠 2互动时间。
2)高架十字迷宫实验。
将小鼠放在十字迷宫正中间，高度距离地面 1 m，两边为封闭臂，另两边为开放臂。用电子路径系统记录小鼠停留在开放臂和封闭臂的时间以及路径。迷宫需用体积分数为 70%的乙醇和水清洗、干燥无味后进行下一只动物实验。
3)新奇-抑制摄食试验。
小鼠剥夺饮食一段时间后，分别放在新物体识别箱(60cm×60cm×30 cm)里。将1粒球状鼠粮置于实验箱底的中心，每只小鼠放于实验箱底的角落，自由活动12min。记录每只小鼠第1次吃到食物的时间，分别记录测试结束后 30 min 内每只小鼠在笼中的饮食情况。
4)强迫游泳实验。
将小鼠放在水桶的中心(水温 24~25 ℃；水桶半径 20 cm，高 40 cm) 10 min。小鼠无法接触水桶的底部。小鼠的行为通过视频路径监控系统自动记录。仪器自动记录小鼠的潜在不动的时间及最后 4 min 的挣扎时间(四肢强烈挣扎、划擦水桶壁)。
5)小鼠取材。
每只小鼠称重后随机分组，每周一下午 18：00锻炼前，用电子天平(JZC-XXC，上海亚津科技有限公司)称量各组小鼠体重。行为测试结束后静置 24 h，断颈椎处死，迅速剥离不同脑区并取血，脑组织样品称重，加入 50 μL 用冰预冷的 0.1 mol/L 高氯酸(含 10-7mol/L 维生素 C)用微量匀浆机匀浆，匀浆液再 5 200×g 离心(4℃) 30 min，然后用 0.22 μm 滤膜过滤并将 10 μL 滤液用 990 μL 蒸馏水稀释到 1 m L，吸取 20 μL稀释液注射到色谱仪进行分析，其他样品迅速置于-80℃保存。
6)单胺类神经递质及其代谢物检测。
小鼠脑部的单胺神经递质及其衍生物采用高效液相色谱荧光检测法：采用 ESA MD-150 色谱柱(150 mm×3.2 mm，2.0 µm)，C18 预柱(10 mm×3 mm，3 µm)。激发波长为 345 nm，发射波长为 480 nm；流动相选择：用 0.45 μm 的微孔滤膜过滤，超声脱气乙腈和 15 mmol/L 醋酸盐缓冲液(p H4.7；35︰65，体积比)流速：1.0 m L/min，柱温：30 ℃，进样量：20 μL。
7)数据统计。
所有数据均录入 SPSS18.1 统计软件，并通过方差分析统计束缚应激以及运动干预的作用。
3 讨论
束缚应激是模拟人类生活压力改变人类社交、情绪及认知等多种行为最常见的动物模型。同时，束缚应激也是广泛应用的应激障碍疾病动物模型，不但可以模拟免疫下降、认知功能下降，还可以使小鼠产生焦虑及抑郁等症状。越来越多的证据说明，束缚应激对脑具有塑造作用，这种塑造作用可以表现为基因、神经内分泌及行为学的改变。应激将单胺类递质系统激活后，会对神经网络结构产生影响，因此重复应激会使机体对应激产生适应。
在应激状态下，实验动物的脑内可出现 5-HT 更新速率增加，使 HPA 轴过度亢进或功能不足，进而导致 5-HT 浓度改变。急性应激使皮层、海马，及杏仁核 5-HT 和其代谢产物 5-HIAA 的含量显著增加；慢性应激皮层 5HT 及 5-HIAA 逐渐恢复到或低于应激前水平。大鼠在 3 h 急性运动后或 8 周跑台运动后，大脑 5-HT 的水平都升高。微透析研究发现，60 min跑台运动后，大鼠海马的 5-HT 水平升高。另外，研究表明，大鼠兴奋水平与脑内 DA 释放成正相关，重复应激后动物海马 DA 水平降低。运动使大鼠前额皮质、海马和纹状体的 DA 水平及其代谢物水平都有所增加。因此，之前的研究似乎表明海马神经元与情绪的兴奋、抑制平衡有关系。
在本研究中，对应激组被试小鼠不同脑区中单胺类递质检测发现，5-HT、DA 及 NE 在大部分脑区中含量均有所降低，部分结果与之前的研究结果相一致，说明束缚应激是易复制的应激动物模型。第 1，本研究证明了束缚应激可以使小鼠焦虑和抑郁行为增加；第 2，本研究的结果同样发现束缚应激降低了小鼠社交行为；最后，本研究发现束缚应激使小鼠不同脑区大多数单胺类神经递质水平下降。总的来说，本研究结果与之前束缚应激小鼠模型结果相一致，证明本束缚应激模型成功复制模拟压力影响个体行为倾向性的模型。
同时，本研究发现小鼠束缚应激后会出现社交互动行为下降、焦虑及抑郁水平增加的情况。这些行为的改变可能与不同脑区抑制性与兴奋性单胺类神经递质失调相关。更重要的是，运动干预可以缓解束缚应激后的焦虑抑郁相关行为、单胺类神经递质及其代谢物水平的改变。这些结果说明周期为 2 周、每天 2 h 的慢性束缚应激可能会使小鼠产生适度的焦虑抑郁行为，而运动干预却降低了束缚应激产生的这种变化。
大量研究证明运动可以用来缓解压力造成的负性情绪及行为，提高认知功能。在前期研究的基础上，本研究用运动干预的方法来缓解压力造成的焦虑、抑郁及社交相关行为的改变。本研究结果说明运动缓解了应激造成的多种行为学及生物学的变化。部分结果与之前的相关研究结果不一致，有待进一步深入研究。
