原位杂交HPV DNA检测技术应用及体会
原位杂交技术是新近开展的一项新技术，其原理是采用荧光、生物素、地高辛等标记的探针，依据碱基对互补配对原理，与组织切片、细胞制片等标本中的靶序列特异杂交，经信号放大显色后，镜下观察结果。此方法具有很高的灵敏性和特异性。本文就HPV DNA检测技术在常规实验中的操作体会等问题，总结如下。
1材料与方法
1．1材料南京中医药大学附属第三医院病理科2006～2007年肛肠外科肛周手术病例。其中男性患者45例，女性55例，平均55岁。试剂均购自福建泰普公司的HPV高危型、低危型试剂盒。
1．2方法
1．2．1切片处理将4Ixm厚组织切片粘附在APES处理的载玻片上。
1．2．2脱蜡玻片经二甲苯3次X20min，100％乙醇2次X3min，95％乙醇1次×3min，70％乙醇1次×3min，蒸馏水2移(X3min。
1．2．3微波修复将切片放入盛有1×杂交增强液的容器里，微波高火状态煮30min，自然冷却至不烫手，蒸馏水浸片2次×2min。
1．2．4杂交(1)小心擦干切片后，每张切片可根据组织的大小滴加适量的探针约25 l，并加盖盖玻片。(2)把切片放置于95℃的原位杂交加热器上变性5arin。(3)放入装有30％湿盒增效液的湿盒中，37℃，孵育4～16h(<16h)。(4)48oCPBS浸片，约2rain，小心移去盖玻片，并擦掉组织周围的探针，48oC PBS继续浸泡10min。(5)然后48℃PBS继续浸片3次×5min。
1．2．5信号放大与显色(1)擦去组织周围的液体，滴加适量的一抗(约50 1)，37℃，水湿盒中孵育30min，37℃PBS浸片3次X2min(轻微振荡容器)。(2)擦去组织周围的液体，滴加适量的二抗(约50 1)，室温，水湿盒中孵育20min， P B S 浸片3 次× 2 m i n 。( 3 ) 擦去组织周围的液体，滴加适量的H R P 聚合物( 约5 0 ¨1 ) ，室温，水湿盒中孵育3 0 ra i n 。( 4 ) 小心擦去组织周围的液体， 滴加适量的D A B 显色剂( 约
5 0 ul ，根据组织的大小增减D A B 的量) ， P B S 终止显色。( 5 ) 自来水冲洗残留的D A B ， 苏木精复染， 盐酸乙醇分化， 氨水反蓝，梯度乙醇脱水， 二甲苯透明，封固。
1 ． 2 ． 6 阳性结果判断上皮细胞核呈棕褐色着色为主。
2 结果
每例标本均做2 张切片， 分别用高危和低危型探针标记。每批切片标记均设高危和低危阳性对照。阳性表达结果：高危型6 3 ． 5 ％ ，低危型2 9 ． 5 ％ ， 阴性7 ％ ， 高、低同时感染约4 5 ． 5 ％ ( 图1 ～ 4 ) ， 说明肛周组织中存在广泛的H P V 感染， 而肛周H P V 感染是否直接致瘤或致癌， 还有待于大样本的系统研究。
3 讨论
H P V 属于乳头瘤病毒科，是一种环状双链D N A 病毒，长约8 k b。目前发现的H P V 亚型有2 0 0 种㈦。其主要通过直接或间接的接触或性传播感染人类， 引起人类皮肤和黏膜的多种良性乳头状瘤或疣，某些亚型的感染具有很强的致癌性。近年来随着分子检测技术的发展，我们可从分子的水平更早期的、更准确地， 检测出低拷贝数下的病毒感染情况”。该技术目前已广泛用于宫颈癌的早期的诊断及其它部位病变、病因学等方面的研究。原位杂交方法虽然容易掌握， 但要达到满意结果， 还需要在制片过程中注意以下几点。
3 ． 1 前期处理( 1 ) 组织固定液采用1 0 ％ 中性福尔马林或4 ％
多聚甲醛磷酸盐缓冲液( p H 7 ． 4 ) ；( 2 ) 切片厚度3 — 4¨m ；( 3 ) 烤片温度大于6 0 ℃ ， 时间1 h
左右；( 4 ) 建议使用A P E S 处理过的干净载玻片， 以减少掉片。
3 ． 2 操作要点( 1 ) 二甲苯要及时更换， 保证组织脱蜡的干净；( 2 )
微波处理须高火，保证3 0 m i n，期间注意补充杂交增强液， 防止干片；( 3 ) 如果使用酶消化，
由于不同的组织，组织存放的时间不同以及切片厚度等存在差异，需要有针对性地摸索最佳消化条件；( 4 ) 盖玻片与组织打大小相匹配，保证在高温9 5
℃ 变性过程中不于片；( 5 ) 建议使用专用的原位杂交仪或变性设备进行高温变性， 以保证变性温度的准确；( 6 ) 杂交温度应保持在3 7 ℃
， 过高或过低会造成阳性信号减弱或背景升高；( 7 ) 杂交时间为4 ～ 1 6 h 为宜，建议过夜为佳， 以提高低拷贝数病毒的检出率；( 8
) 在杂交过夜过程中， 要配有3 0 ％ 增效液的湿盒， 以降低水份对探针稀释的可能性；( 9 ) 3 0 ％ 增效液的湿盒可以重复使用，
但建议每次使用前补充适量的蒸馏水，避免因增效液浓度升高造成背景升高；( 1 0 ) 杂交之后请使用4 8 ℃ 高温充分浸片，
以除去非特异性杂交；( 1 1 ) P B S 缓冲液的p H 值应在7 ． 4 ～ 7 ． 6 之间， 保证最佳洗涤效果；( 1 2 ) D A
B 显色液应现配现用， 以保证显色效果。
