高通量测序技术鉴定新生儿窒息性胸廓发育不良症-1
窒息性胸廓发育不良(asphyxiating thoracic dystrophy,ATD), 由Jeune等于1955年发现, 又称为Jeune综合征(Jeunesyndrome)[1-2], 是一种罕见的常染色体隐性遗传病, 为多系统受累疾病, 在活产新生儿中发病率约1/130 000~1/10 000[3], 胸廓、骨盆畸形及四肢短小是其最典型的临床特征。
本研究对1例多器官发育不良的患儿及其父母采用高通量全外显子组技术并
Sanger 测序验证, 检测到患儿存在DYNC2H1 基因的复合突变,
分别是父源、母源的杂合突变c.8512C>T(p.R2838*)和c.10163C>T(p.P3388L),
其中c.8512C>T (p.R2838*)为已报道的致病性突变, 而c.10163C>T(p.P3388L)预测为致病突变,
结合临床特征最终诊断为DYNC2H1 突变导致的窒息性胸廓发育不良。
1 研究对象与方法
1.1 研究对象 患儿, 女, 15 d, 因出生后气促伴青紫11 d入院。第1胎第 1产, 足月剖宫产。出生后即刻出现呼吸, 无窒息史。脐带绕颈半周, 无扭转。父母健康, 非近亲婚配,否认遗传病家族史。
1.1.1 体格检查 体温36.7 ℃, 心率152次/min, 呼吸70次/min,体质量2.91 kg, 血压72/40 mm Hg, 身长49 cm, 头围33 cm, 胸围27 cm, 明显小于正常, 腹围30 cm, 发育异常, 反应差, 哭声低,呼吸急促, 强迫体位, 三凹征阳性, 肤色青紫, 面色青, 口周绀,颈抵抗弱阳性, 头后仰。气管居中, 胸廓短、窄, 双侧对称,双侧呼吸动度均等, 双肺呼吸音略低, 闻及湿啰音。心律规整, 心音低钝, 心前区未闻及杂音。腹膨隆, 触软, 肝右侧锁骨中线肋下5 cm, 剑突下5 cm, 质韧, 边略钝; 脾左肋下未触及, 腹部未触及异常包块, 肠鸣音4次/min。四肢肌张力低。指(趾)甲紫绀, 双手通贯掌, 手指粗。前臂毛细血管再充盈时间3 s。前臂弹回1分, 围巾征不过中线, 扶坐屈颈2分, 腘角>90°, 足跟不能触耳。拥抱反射不完全, 握持反射减弱。
1.1.2 实验室检查 ①心脏B超: 动脉导管未闭, 肺动脉高压(轻-中度), 卵圆孔未闭,
三尖瓣返流(轻度)。②胸腹部立位片: 双侧胸廓欠自然, 横径小, 双侧肋骨短, 似水平伸出, 肋软骨端不规则; 双肺纹理增多、紊乱、模糊,
两肺野伴有斑片状模糊阴影; 双侧肩胛骨形态欠规整(图1)。③胸部X线: 心影增大饱满; 腹部肠管充气较少, 右侧腹部较密实。④骨盆X线:
未见明显异常。⑤腹部B超: 肝脾大; 双肾、输尿管、膀胱、腹腔、甲状腺及双侧颈部扫查未见明显异常。⑥生化检查: 存在肝功损害, 直接胆红素升高,
谷丙转氨酶 57 U/L, 总胆红素62.1 μmol/L, 直接胆红素33.9 μmol/L, 间接胆红素28.2 μmol/L, 谷氨酰转肽酶1 493 U/L, 谷草转氨酶90 U/L。肾功能、心肌酶正常。
1.2 遗传学检测
1.2.1 样本采集与DNA提取 该研究符合医学伦理基本原则, 经伦理委员会批准及患儿家长知情同意后, 抽取患儿及父母外周静脉血3 m L, EDTA抗凝, 采用天根血液基因组DNA提取试剂盒提取 D N A 。
1.2.2
高通量全外显子组测序与Sanger测序验证 采用高通量全外显子组测序技术, 构建基因组DNA文库,
通过探针杂交捕获人类全部基因的外显子区及相邻内含子区域(50 bp), 并进行富集。富集的目的基因片段通过Hi Seq
2000测序仪(美国Illumina公司)进行高通量测序。分析该患儿全外显子组测序结果,
缩小候选变异的范围,并对目标区域的覆盖度和测序质量进行评估, 依据严格的筛选标准对变异进行过滤,
根据可疑的基因突变位点设计引物,对该患儿及其父母样本进行Sanger测序验证。
1.2.3 基因突变位点致病性预测分析
运用Next Gene V2.3.4软件将突变数据与UCSC数据库的人类基因组hg19参考序列进行比对, 并添加 HGMD
数据库、蛋白功能预测软件、遗传病数据库(OMIM)的相关注释信息, 参考Pubmed的文献对基因突变位点进行致病性分析。
2 结果与分析
2.1 全外显子组测序及Sanger测序结果 患儿外周血中检测到DYNC2H1基因复合突变, 分别是第53外显子c.8512C>T(p.R2838*)杂合错义突变(图 2A), 以及第 66 外显子 c.10163C>T(p.P3388L)杂合错义突变(图2B)。Sanger测序结果显示, 受检者父亲携带DYNC2H1基因c.8512C>T(p.R2838*)杂合突变(图3A), 受检者母亲携带DYNC2H1基因c.10163C>T(p.P3388L)杂合突变(图3B)。
2.2 突变位点致病性分析预测 DYNC2H1基因c.8512C>T(p.R2838*)杂合突变, 为人类基因突变数据库(HGMD)报道的已知致病性突变[6]; c.10163C>T(p.P3388L)杂合突变为一新发现的突变, 未见文献报道, 在外显子集成联合数据库(ExomeAggregation Consortium, Ex AC)东亚人群和千人基因组计划数据库(1 000 G)中都未收录该位点的突变。采用Mutation Taster和SIFT软件分别对该新突变位点c.10163C>T(p.P3388L)的致病性进行分析, 理论预测为致病性突变, 其中Mutation Taster软件显示“disease causing”, SIFT软件显示 “DAMAGING”, 计算得分为 0。
2.3 新突变蛋白二级结构预测 为进一步确定新突变位点可能对蛋白结构和功能产生的影响, 我们采用蛋白结构预测生物学软件Ex PASy预测p.P3388L突变蛋白的二级结构, 结果为野生型DYNC2H1蛋白α螺旋占的比例为55.49%, 延伸链13.75%, β-转角7.14%(图4A); 而p.P3388L突变蛋白, α螺旋占55.52%, 延伸链13.77%, β-转角7.09%(图4B), 均发生了改变, 该结构的变化可能导致DYNC2H1蛋白功能的改变, 但还需进一步用细胞模型和动物模型等试验进行验证。(p.P3388L)预测为致病突变, 结合临床特征最终诊断为DYNC2H1 突变导致的窒息性胸廓发育不良。
双侧胸廓欠自然, 横径小, 双侧肋骨短似水平伸出, 肋软骨端不规则;心影增大饱满图1 胸腹部立位片
