DNA片断的酶切技术
限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,这类酶的发现和应用促进了以DNA重组为基础的生物工程技术的迅猛发展。该类酶是体外剪切基因片段的重要工具，基因物理图谱的绘制、核苷酸序列的测定、基因片段的重组，重组子的筛选、探针的制备及各种杂交、测量基因的拷贝数,基因文库构建,分子标记等都离不开限制性内切酶的应用。另外以限制性内切酶为基础的各种限制性内切酶片段长度多态性分析，促进了分子遗传学、分类学等相关学科的应用和发展。可以这么说，没有限制性内切酶的发现和应用就没有现代意义上的分子生物学、分子遗传学，也就不会有任何基因工程产品。而对于从事分子生物学或相关领域研究工作的人员讲来，如果不能很好地了解和掌握内切酶技术，那就根本不可能开展这方面的任何工作。
本部分实验主要通过EcoRⅠ，Hind III两种限制性内切酶对λDNA的单酶切、双酶切及部分酶切的操作，使学员能掌握内切酶的实验操作技术
一：仪器：
离心机 、 恒温水浴 、取液器、 电泳仪 、电泳槽、 紫外观测仪
易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
二：试剂
EcoRⅠ,Hind Ⅲ,λDNA/HindⅢ及λDNA/EcoRⅠ 标准质粒（或其他DNA样品）（浓度>0.5μg/μl） TAE缓冲液
三：操作
(一)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ单酶切及双酶切
1, 取２支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入
Ａ(μl) B(μl)
灭菌水１3１3
EcoR Ⅰ缓冲液２
Hind Ⅲ缓冲液２
λDNA （或质粒DNA ） 4 4
EcoR Ⅰ１
Hind Ⅲ１
总体积２０２０
２，37℃保温１－4小时
3，保温结束后65-70℃10min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提)
4，取2μl左右的反应液加入2μl电泳加样缓冲液，电泳
（二）EcoR Ⅰ、Hind III双酶切
1,取一支干净、灭菌Eppendof管，按下表加入各种试剂
加入试剂体积（μl）
灭菌水 1２
MULT buffer 2
λDNA（或质粒DNA） 4
EcoRⅠ１
HindⅢ１
总体积 2０
２，37℃保温１－２小时
３，保温结束后65-70℃10min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提)
４，取2μl左右的反应液加入2μl电泳加样缓冲液，电泳
注意：１，样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒，
２，加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀
３，反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一般水解0.2-1ug模板DNA时，应将体积控制在20－30ul内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10,因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体积高于总体积的1/10,则反应液中甘油浓度将大于５％，而此浓度将抑制内切酶活性。
4，为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，否则反应体系中DNA浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果，此时不得不增加反应体积；而一般为了增加DNA储藏的稳定性，DNA多保存在TE缓冲液中，如反应体系中过多加入模板DNA溶液则势必造成反应体系中EDTA浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低则应进行浓缩。
5，本实验中双酶切时，因两种酶的缓冲液盐浓度要求相同，所以，可在同一反应体系中完成双酶切。但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同，则不能将两种酶同时加入同一体系，进行反应，此时可采取下列处理办法
a:先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA，然后加入适量的NaCL及第二种酶，继续保温。
b:使用所有限制酶均可作用的单种缓冲液(谷氨酸钾缓冲液)。
C:一种酶水解完后，进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶然后进行第二种酶切。
在上述3种方法中遇到最多的可能为C
6，在水解结束灭活酶时可采用65℃加热10分钟或加EDTA至终浓度10mM，二者各有利弊，加热简单但对有些酶灭活不彻底。EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接反应变得极为困难，因此在连接前要求重新用有机溶剂抽提，这将增加操作难度和导致DNA的损失。
