液体活检助力癌症早期诊断
被称为“生命健康第一杀手”的癌症令人闻之色变，但如果能早点找出这个“杀手”，它便难以“行凶”。列入国家重点研发计划的“恶性肿瘤筛查早诊的液体活检技术研发及评价研究”项目日前在京启动，助力多癌种早筛关键技术突破。
“早筛早诊是降低恶性肿瘤死亡的最有效途径。”项目负责人、中国医学科学院肿瘤医院内科主任王洁教授说，高通量液体活检是实现癌症早筛早诊的突破口，但目前这项技术的研究面临检验灵敏度不足、缺乏液体活检的高特异性的分子靶点等瓶颈。
该项目为国家重点研发计划“重大慢性非传染性疾病防控研究”重点专项支持项目，目标是重点突破恶性肿瘤筛查及早诊早治液体活检关键技术，构建高灵敏度、高特异性、高效经济的恶性肿瘤液体活检早诊技术体系，开发具有完全自主知识产权的筛查/早期诊断试剂盒，并针对肺癌和消化系统癌症在大规模多中心前瞻性队列中验证其有效性。中国医学科学院肿瘤医院结直肠外科副主任刘骞认为，通过抽取外周血检测肿瘤细胞释放到血液中的游离DNA，可以提高早期癌症和癌前病变的检出率。“随着技术不断完善和发展，这种方法完全有可能达到和侵入性检查相近的灵敏度和特异性，同时做到操作简便、无创、流程标准化。”“我国恶性肿瘤患者到医院就诊往往偏晚。”中国科学院院士、国家癌症中心主任赫捷在项目启动仪式上说，癌症筛查和早诊早治的研究应该更加深入、普及和实用，使患者获益。
每年，无数人的生命被癌症夺走。如果能在癌症早期阶段就做出准确的诊断，将帮助患者赢得更多的治疗时间，“液体活检”技术应运而生。液体活检即通过检查各种体液，来检测癌症和监测疾病进展。
来自纪念斯隆·凯特琳癌症中心和威尔·康奈尔医学研究所的研究团队在《细胞》发文称，由肿瘤和免疫细胞释放的细胞外囊泡和颗粒（EVP），携带可靠的生物标志物，可用于早期诊断多种癌症，并确定癌症的类型。
无独有偶，《柳叶刀—胃肠病学和肝病学》也报到了一项在研血液检测技术NIS4，这种无创诊断方法可用于识别合并代谢风险因素的高危非酒精性脂肪性肝炎（NASH），有助于减少低危患者不必要的肝脏活检。
随着技术的不断进步，不久的将来，液体活检有望让更多癌症患者免受“活检”的痛苦，把癌症扼杀在萌芽之中。不过，就目前来看，液体活检彻底替代组织活检，仍需时日。
发现全新生物标志物
“癌症的形成是个长期的过程，在细胞刚刚发生癌变但却还没有形成癌灶之前，就会在体液中产生一些游离的‘破坏分子’。”南京大学生命科学学院教授朱海亮告诉《中国科学报》，液体活检通过非侵入性取样，如血液、唾液、尿液等，利用高通量测序技术、过滤、捕获或富集体内肿瘤细胞的基因组信息，从而找出癌症的蛛丝马迹。目前，液体活检的四种主要肿瘤来源的生物标志物分别是循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、外泌体和循环RNA。威尔·康奈尔医学研究所教授David Lyden团队则另辟蹊径，不是分析DNA片段，而是侧重于检查EVP中包含的各种蛋白质。EVP是细胞分泌的小颗粒，大小只有纳米级别。它们像快递包裹一样，外层有膜，里面可以装RNA、DNA、蛋白质、代谢产物和脂质等活性分子。这些小包裹可以介导细胞间信号传导，调节基质组织，甚至调节炎症和免疫反应，还可以穿越血脑屏障，并以高度的特异性被“吞”入细胞。“一小管血液中就含有数十亿EVP，这意味着，癌症患者有大量的癌症相关EVP可供临床医生用来诊断。”David Lyden表示，肿瘤在生长、转移的过程中都会释放EVP，并以这种方式通知身体的其他部位做好迎接癌细胞的准备。因此，理论上通过检查不同EVP的内容物，可以推断出癌症的信息。同样，生物制药公司GENFIT研发的NIS4技术，则筛选出4个独立且能形成最佳整体诊断性能的生物标志物——miR-34a -5p，与脂肪变性/炎症/肝细胞气球样变有关；alpha-2巨球蛋白，肝纤维化标志物；YKL-40，肝纤维化标志物；糖化血红蛋白（HbA1c），代谢/胰岛素抵抗标志物。研究人员称，NIS4技术在这4个标志物综合分析的基础上，无需再结合年龄、性别、体重指数（BMI）或转氨酶浓度这些指标进行评估，就可以识别合并代谢风险因素的高危NASH患者。在接受《中国科学报》采访时，厦门市第五医院检验科主任张军能评价道，NIS4涵盖的四个指标可检测肝细胞的变性、炎症、气球样变、肝纤维化程度等非酒精性脂肪肝病变的重要病症，同时又能指示胰岛素抵抗这个NASH发病的核心元素。因此，NIS4的四个指标既能提示核心发病因素的存在，又能指明疾病重要病症的存在，对NASH具有很好的诊断意义。
目前还不能替代“活检”
与传统的穿刺组织活检相比，液体活检具有诸多不可比拟的优势。
朱海亮指出，第一是精准，该技术可以直接获得肿瘤基因组信息，同时用于指导后续靶向治疗；第二是全面连续，避免肿瘤异质性带来的取样局限；第三是无创方便、重复性好，不仅降低了活检导致的不良反应，还可以多次取材；第四是多种基因联合筛查可以提高特异度和敏感度；第五是实时判断疗效，能够随肿瘤的发展态势及时调整治疗方案。
不过，这并不意味着，液体活检就能够完全取代组织活检。张军能以NIS4技术诊断NASH为例称，从NASH的识别来说，灵敏度至关重要，而从研究的验证结果可知，NIS4技术对NASH的实际高危者，灵敏度只有50.7%。对于高危人群，这个灵敏度严重不能满足临床要求；对实际非高危者其灵敏度为81.5%，即使有提高，但此种情况下仍然还不足于替代活检。
除此之外，从NASH的诊断要点而言，其诊断需评估肝脂肪变、肝细胞损伤、炎症坏死和纤维化程度、肝脂肪变、气球样变等病症的必要条件，而这些条件评估是目前NIS4所不能实现的。
张军能表示，组织活检虽然具有创伤和并发症的风险，存在因取样误差导致诊断结果的偏差，以及病理检测者的经验差异导致结果不同等缺点，但是活检至今仍是诊断NASH的金标准，也是唯一金标准，可准确评估肝脂肪变、肝细胞损伤、炎症坏死和纤维化程度、肝脂肪变、气球样变等诊断NASH的必备条件。
江苏省肿瘤医院临床肿瘤实验中心主任吴建中也曾表示，目前，在肿瘤的筛查方面血液检查主要是检测血液中的肿瘤标志物。采用此类方法做癌症早诊，要考虑特异性和灵敏度，而且检测结果只能作为辅助诊断的指标，疾病的判断还需经过一系列相对应的辅助检查，最终确诊是依靠病理诊断。
此外，液体活检还面临着其他挑战，如DNA片段太小、半衰期短、来自正常DNA污染的风险，以及随着治疗效果显现，肿瘤DNA比例会大幅度下降等等。多位专家表示，临床中液体活检还没有形成金标准，因此还不能完全代替组织活检。
“做一次防癌体检的费用和癌症基因检测的费用差不多，不如做一次真正的防癌体检。”吴建中呼吁，癌症要早诊早治，这样治愈的可能性才会更大。
现阶段，液体活检关联的市场增长非常快。全球液体活检市场从2018年的12.44亿美元增长到2025年的约120.62亿美元，2019年至2025年间的复合年增长率达38.3％【1】。这一市场包括CTC、ctDNA和外泌体应用的硬件(包括系统和设备)和试剂盒销售，以及服务收入。目前，液体活检分析物还是主要集中在 ctDNA 和 CTC 的捕获和分析上。整个市场的产业化发展也很迅速，目前已有多项液体活检产品获准进入临床，更有许多转化研究在蓬勃开展。尽管液体活检技术的临床应用仍然面临着诸多挑战，标准化与质量管理体系还有待完善，但是液体活检作为应用前景广阔的检测新技术，将成为临床迫切需求并值得信赖的诊断工具，特别是在已上升到了国家战略高度的癌症早诊领域的应用。癌症的早期诊断目的是为了减少在晚期被诊断出的患者的比例，在尽可能早的阶段提供护理来改善癌症结果（图1）。
图1 各癌种中早期诊断和晚期诊断的5年生存率比较
早在2016年，在The Lancet Oncology杂志在发表了一篇述评《癌症液体活检：癌症检测的未来？》【2】，在这篇述评中对GRAIL公司的一项计划——“通过血液筛查及早发现无症状个体的癌症”（the early detection of cancer in asymptomatic individuals through a blood screen）进行了讨论。GRAIL公司的这个计划旨在创建一种通用的血液检测方法，从而可以对无症状个体进行多种类型的癌症筛查。文中提到了ctDNA应用于肿瘤领域的一些难题需要去克服：
(1) 首先，目前还没有通用型的用于筛查任何疾病阶段或癌症类型的ctDNA产品，是因为检测低浓度的ctDNA很难，突破这一局限性需要通过更灵敏的技术来克服，但敏感度的提高会导致来自胚系的噪声增加，这反过来又会使技术人员很难区分肿瘤相关的DNA突变和非肿瘤相关的DNA突变，从而导致检测结果假阳性的风险增加。
(2) 第二，ctDNA检测到底会检测到什么，这项检测可以区分什么？例如，并不是所有的癌症都与早期基因突变有关，而且许多癌症都有可能在任何疾病阶段、以不可预测的方式出现的多个基因突变，除非发现一种新的、尚未发现的泛癌标志物，否则通用型的ctDNA检测的设计会比较复杂。
(3) 第三，并不是所有的肿瘤都以同样的方式将ctDNA释放到血液中。相反，研究表明，ctDNA浓度不仅与肿瘤负荷直接相关，而且与克服血脑屏障或粘液组织等障碍进入血液的难易性有关。
(4) 第四，任何新的诊断检测都必须经过临床验证，这是监管批准的必要步骤，因此，ctDNA检测在肿瘤领域的应用需要有更多的临床验证。
(5) 第五，临床医生等如何处理泛癌检测结果的有关信息也是一个问题，因为早期检测是为了降低与癌症相关的死亡率，然而，在无症状的未经选择的人群中进行筛查的价值仍然存在争议，过度治疗仍是一个令人担忧的问题，过度治疗可能会严重恶化生活质量，带来与初心相反的后果。
从爆发的临床研究我们不难看出，液体活检应用于癌症早筛早诊离我们越来越近，结合液体活检方法与当前的筛查手段，可能会大大改善肿瘤的诊断。随着技术的发展，价格将会成为液体活检在肿瘤早筛早诊领域考量的重要杠杆。从这次COVID-19疫情中，我们获得的一个明显教训是，即使在高收入国家，大规模检测也可以迅速加剧卫生系统中现有的资金不足。考虑到全球范围内癌症数量的快速增长，类似问题的考虑对癌症也尤为重要。对于政府、保险公司，甚至是检测服务公司来说，必须要清晰了解通过早期发现和治疗癌症而获得的长期资金节省的理由，以及相应的液体活检检测能否具有适用于大规模人群的成本效益。相信技术研发的发展，对所有人都进行癌症液体活检会成为可能。
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