毕赤酵母LiCl 转化方法
实验概要
本文介绍了毕赤酵母LiCl 转化方法。该程序是电转化的替代方法。转化效率为102-103cfu/ug线性化DNA。
主要试剂
溶液准备：不能用醋酸锂，一定要用氯化锂
1. 用无菌去离子蒸馏水配制1M LiCl，过滤除菌，用无菌水稀释
2. 用无菌去离子蒸馏水配制50%PEG(3350)，过滤除菌，存于盖紧的瓶中
3. 用TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA)溶解2mg/ml 变性断裂鲑鱼精DNA，存于-20度
实验步骤
1. 细胞准备：
1) 在50mlYPD 中培养毕赤酵母至OD600＝0.8-1.0(约108个/ml)。
2) 收集细胞，用25ml灭菌水洗涤，室温1500g离心10min。
3) 去除水，用1ml 100mM LiCl 重悬细胞。
4) 将细胞悬液转至1.5ml 离心管中。
5) 最大转速沉淀细胞15s，用吸头吸去LiCl。
6) 在400ul 100mM LiCl中悬浮细胞。
7) 将50ul细胞悬浮液移到1.5ml离心管中，每次用一管，现做现用，不要置于冰上或-20度保存。
2. 转化：
1) 煮沸单链DNA 5min，快速放于冰水中使变冷，后置于冰上。
注意：载体DNA不需要在每次用之前都煮，在-20 度保存等份少量样品，每次解冻一管，用3-4 次后再煮。
2) 取上面第7步中细胞，离心去除LiCl。
3) 每个转化样品，按顺序加入下列试剂，PEG 可保护细胞免受高浓度LiCl的有害作用240ul 50%PEG，36ul 1M LiCl，25ul 2mg/ml 单链DNA，溶解于50ul灭菌水中的质粒 DNA(5-10ug)。
4) 剧烈涡旋细胞沉淀至完全混匀(1min)。
5) 在30 度孵育30min(不要摇动)。
6) 在42 度水浴热击20-25min。
7) 6000-8000rpm离心，将转化溶液转移走。
8) 用1ml 灭菌水重悬细胞沉淀。
9) 在RDB或MD 平板上涂25-100ul，在30 度孵育2-4天，筛选转化子Mut 表型及遗传霉素高抗性克隆。
