植物总核酸提取原理、方法和特点
1、原理与特点
核酸主要包括 DNA 和 RNA,利用尿素缓冲液、饱和酚、氯仿提取与无水乙醇沉淀得到植物总核酸,若再利用 RNase 分解 RNA 即可得到 DNA,若利用 LiCl 沉淀总核酸,即可得到 RNA。该方法可从同一材料中同时提取 DNA 和 RNA,操作快速、方便,适用于常见新鲜的或冷冻的植物性食品材料检测。
2、试剂
尿素缓冲液:8mol/L 尿素,0.5mol/L Tris·Cl( pH8.0):0.35mol/L NaCl 20mmol/L EDTA(抽滤灭菌):Sephadex G-50柱;4mol/L LiCl。
3、方法
(1)取 0.5g 材料加入液氮研磨成粉。加入 5L 尿素提取缓冲液,转入离心管中,涡旋振荡30s。
(2)依次加入 200μL 饱和酚和 200μL 氯仿至试管中,轻轻混匀,于室温下 3500r/min离心5min。
(3)取上层液至另一管中,加入500μL 氯仿,轻轻混匀,离心(条件同上)。
(4)加入2倍体积的无水乙醇,室温下放置30min。之后,10000r/min 离心15min。去上清液。
(5)用70%乙醇漂洗沉淀,室温下 3500r/min 离心 5min,去上清液,沉淀于室温下吹干。
(6)将沉淀溶于 200μL 无菌蒸馏水中,根据实验需要分成两部分,分别进行 DNA 及RNA 的提取。
若继续提取 DNA,需进行如下操作:
①在100μL 核酸溶液中加入1～2μL RNase,37℃保温30min;
②加入饱和酚和氯仿各 50μL,混匀,室温下10000r/min离心10min;
③Sephadex G-50柱层析纯化。
若继续提取 RNA,需进行如下操作:
①在 100μL 核酸溶液中加入 150μL 无菌水,混匀;
②加入3倍体积的 4mol/L LiCl,混匀,于冰上沉淀30min;
③4℃、12000r/min 离心30min,去上清液,沉淀吹干,溶于150μL无菌水;
④加入450μL4mol/L LiCL,混匀后置冰上沉淀30min;
⑤4℃、12000r/min 离心30min,去上清液,用70%乙醇洗沉淀一次,吹干,溶于适量无菌水中,备用。
