一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

（一）试剂配制

1．30% 丙烯酰胺（29：1）：

2．1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8

3．1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8

4．10%SDS（室温保存）:

5．10%过硫酸铵（4℃保存）：

6．TEMED（N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺）：催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰

胺和双丙烯酰胺的聚合；

7.Tris -甘氨酸电泳缓冲液(1000ml):

8．2×蛋白质电泳上样缓冲液

9. 蛋白质预染Marker

（二）实验仪器及耗材

垂直电泳槽

稳压稳流电泳仪/电转仪

蛋白变性用加热仪器

无菌Tip 头、 Ep 管、碎冰 、注射器等

（三）实验步骤

1．制备SDS-PAGE 凝胶

（1）准备SDS-PAGE 凝胶用玻璃槽：

将两条垫片放入两块特制玻璃板中间（其中一块为凹形），用透明胶带将两边及底边封

严。确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-25px处）。

（2）配制10%SDS-PAGE 分离胶 (15ml)：

去离子水 5.9ml

30%丙烯酰胺 5.0ml

1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 3.8ml

10%过硫酸胺 0.15ml

10%SDS 0.15ml

取上述液体1ml, 加入TEMED 3ul, 混匀后用其封凝胶用玻璃槽周边

（3）灌制分离胶：

待封边胶凝固后，在其余14ml 分离胶液中加入7 ul TEMED，混合均匀，用吸管轻轻加

入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。

（4）立即用0.1%SDS 液覆盖胶面（隔绝空气,有助于凝胶聚合，使凝胶面形成平直），

室温放置约40 分钟至分离胶凝固。

（5）配制5%浓缩胶4ml（此步操作可在配制分离胶时同时进行）：

去离子水 2.7ml

30%丙烯酰胺 0.67ml

1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 0.5ml

10%过硫酸胺（一周内使用） 0.04ml

10%SDS 0.04ml

TEMDE（临灌胶前再加） 0.004ml

（6）倒掉0.1%SDS 覆盖液，用去离子水冲洗分离胶表面3-4 次，以洗净未聚合的丙烯

酰胺凝胶（避免在胶顶部或玻璃夹板中留有气泡），并用吸水纸吸掉残留的液体。

（7）将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%积层胶液（注意避免产生气泡），插入样品

梳，使液面至样品梳上标志线位置， 室温凝胶约40 分钟。

（8）轻轻拔去梳子，撕去封玻璃夹板用透明胶带，将玻璃夹板“凹”面贴紧电泳槽，

两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。用针头式注射器吸取电泳缓冲液轻轻冲洗点样孔，以去

除未聚合的凝胶。

2．样品变性及电泳

（1）由-80℃冰箱取出提取的Hela 细胞总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）

待其融化。

（2）吸取细胞总蛋白样品15ul 加入0.5mlEP 管中, 每样品管中分别加入5ul 4×蛋白

质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，98℃变性5 分钟，立即插入冰中，voltex 数秒，短暂

离心.

（3）吸出变性蛋白液，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加至凝胶孔中。

（4）将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V 使样品通过浓缩胶（电压

约8v/cm）。当染料进入分离胶后，将电压调高到120V（约12v/cm ),继续电泳使染料至分

离胶适当位置（4℃冰箱中进行电泳）,结束电泳。

3．注意事项

（1）设立必要蛋白质分子量标志物

（2）丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积

性。故称量时应戴手套及口罩；

（3）不同厂家的SDS 可引起多肽的迁移图谱变化较大，建议找出个人喜欢的某一试剂

级别并认准使用。

（4）一旦加入TEMED，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹板。

（5）过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制;

（6）在多余的样品孔中加入适量的蛋白质电泳上样液， 将会有助于保持电泳系统的平

衡。

（7）正确连接电泳连线正、负极方向（负极在上，正极在下）以保证电荷由负极向正

极方向流动。

（8）凝胶玻璃板要定期做硅化处理: 用氯仿或庚烷配成5%二氯二甲硅烷溶液，用其浸

泡或擦拭玻璃板，有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲

洗多次或于180℃烘考2 小时。

凝胶转膜及其检测

    凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物

上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。

用于Western 印迹法的固相支持物有多种，NC（**纤维素）膜较为常用。

本实验采用NC 膜作为固相支持物。

    转膜的方式有湿转和半干转，本实验采用湿转方法。

一、转移电泳

（一） 试剂

1．转移缓冲液

2．考马斯亮蓝快速染色液(膜－胶10秒钟可逆染色液 (P1601，MemStain)

（二）仪器及耗材

1．转移电泳仪

2．转移电泳槽

3．NC 膜、剪刀、滤纸等

（三）实验方法

1．NC 膜及滤纸的预处理：

剪裁与胶大小一致的NC 膜，将其浸入1×转移缓冲液平衡5 分钟以上。（注意：必须保

证NC 膜始终完全浸于转移缓冲液中）

2．剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用；

3．取下电泳板，将其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉

上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用1×转膜液漂洗一次。

4．转膜

① 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片

→3 层滤纸→样品胶→NC 膜→三层滤纸（注意：排除气泡）→海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意图）。

②正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，80v

转膜2h（此步操作宜在4℃冰箱中进行）。

③小心取出转移膜，在1×TBST 液中漂洗两次