临床生化自动化分析（五）
三、单试剂和双试剂方式
反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式。目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析，其优点是：①可提高试剂的稳定性，多数双试剂混合成单一工作试剂时，其稳定时间缩短；②能设置两点终点法，来消除来自样品本身的光吸收干扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰。如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反应，使结果偏高。若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD＋能真正反映ALT的活性，从而消除以上副反应的影响。
四、测定过程的自动监测
各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性。高档分析仪的监测功能更强。
1．试剂空白监测 每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等。
试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪。
2．试剂空白变化速率监测 一些酶试剂在反应温度下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化，这种变化的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同。这种变化会影响测定结果的准确性，一般使结果偏高。如果设置此项监测，分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变化速率。在以监测NAD（P）H减少为指示反应的酶活性测定中，空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用，已如前述。
3．样品信息监测 由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这部分干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性。
4．结果可靠性监测
（1）终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点。一些分析仪在所选终点后再选一个测光点，比较这两点吸光度的差异来判断反应是否到达终点。
（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性。其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。
5．底物消耗的监测 在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定。此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。见图7-9
6．方法线性范围监测 每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示，多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。
四、分析参数设置举例
以肌酸激酶的某通用试剂盒在某分析仪上使用为例，设置其反应程序中的主要参数。
1．某生化分析仪有关参数的设置范围 样品量2－35?l，第一试剂量20－270?l，第二试剂量20－270?l，总反应容量180－350?，吸光度监测周期18s，总反应时间10min，各试剂可加入时间：1.5min，4.5min，9.5min。
2．肌酸激酶试剂盒通用参数 样品量50?l，第一试剂1000?l，37℃保温5min，加第二试剂500?l，延滞时间2min在340nm读第一点吸光度，连续监测2min。
3．根据以上条件进行参数设置
（1）按比例减少样品量和各试剂量：使反应液总容量在分析仪180－350?l范围内。选择样品量为10?l，第一试剂200?l，第二试剂100?l，这时反应液总容量是310?l。或者选择样品量为8?l，第一试剂160?l，第二试剂80?l，这时反应液总容量是248?l。
（2）确定第二试剂加入时间：根据通用参数，应选择4.5min为第二试剂加入点。
（3）确定各个吸光度选择点：由于第二试剂加入时间4.5min，换算成监测周期为第16，17点之间，加上2min延滞时间，则在第24监测点为第一点吸光度，并连续选择24-31监测点。
（4）计算K值：根据样品量10?l，第一试剂200?l，第二试剂100?l，代入计算公式
则K = = = 4984
也可以采用肌酸激酶的校准品，执行校准程序来得到校准K值。
4．对新设置的反应参数进行试运行 在开始运行时，分析仪会对各反应参数之间的逻辑合法性进行检测，如果反应参数中出现逻辑性错误，则分析仪会显示错误信息并停机，这时可以根据提示信息对反应参数进行修改。
第四节 自动生化分析仪的工作过程和操作方法
一、工作过程
在测定过程中所有机械步骤均由微处理器根据已设定的程序（procedure）进行工作。
1．取样加试剂和混匀 样品盘转动，使样品进入待测位置，样品针定量吸取样品加入一反应杯；反应盘旋转；试剂转盘转动使所需试剂瓶进入试剂吸取位置，试剂针定量吸取试剂加入反应杯；搅拌机构将反应杯内液体进行搅拌混匀。此后，便按递进原理对下一样品进行采样、加试剂等同样操作。
2．保温反应和吸光度检测 反应盘旋转，反应杯内液体在恒温条件下进行化学反应，当该反应杯通过吸光度检测窗口时即被检测得到一个吸光度值；再按规定的间隔时间检测反应过程中的吸光度值直至总反应结束。总反应时间一般为10min，如果18s为检测吸光度的间隔时间（interval time），则10min得到34个吸光度值，若15s为间隔时间，则得到40个吸光度值。
分析仪能显示或/和打印反应全过程的时间－吸光度曲线，从这条曲线上，能观察和计算化学反应的速度、时间，以及反应呈线性段的时间，从而可为确定分析方法类型、参数设置等提供依据。
3．计算并显示或打印结果 分析仪根据各测光点读数对某一检测项目进行结果计算，并显示或打印出每个项目的报告，也可按标本显示或打印出全部项目的累积。即待某样品指定的项目测试完毕，便显示或打印检测结果。
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