外泌体NfL，轻度创伤性脑损伤后远隔症状的诊断性生物...
导读
持续轻度创伤性脑损伤（mTBI）是一种复杂的、异质性的损伤，其病理机制包括神经轴索损伤和血管损伤，并伴有强烈的炎症反应。机械组织损伤后，受损细胞释放外泌体到胞外空间。外泌体可以穿过血脑屏障，并可以从外周循环系统中分离出来，因此可以很容易地从外周循环中检测其含量。外泌体所携带的物质可以使研究人员更加简单方便地对中枢神经系统组织特异性的病理过程做出解析。
本研究通过对具有mTBI病史的退伍军人进行研究，验证了外周循环系统（外泌体和血浆）中候选TBI生物标记物（NfL、IL-6、IL-10、TNF-α和VEGF）与持续性神经行为症状之间的关系。
研究中使用Simoa HD-1分析仪，检测NfL、IL-6、TNF-α、IL-10和VEGF在外泌体和血浆中的浓度水平并进行分析。Simoa HD-1分析仪是一款全自动数字式单分子免疫阵列检测技术平台，是基于其声名显赫的单分子免疫阵列技术（Simoa）开发的超灵敏的蛋白质检测平台，其检测的平均灵敏度是传统技术的1000倍。
发表期刊： Neurology；IF=8.689
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32461282/
研究背景
mTBI与损伤后数年内持续存在的或恶化的神经行为功能障碍有关。常见的创伤性脑损伤（TBI）临床后遗症和合并症，例如脑震荡后遗症（PCS），创伤后应激障碍（PTSD）以及抑郁症都有着明显的症状重叠，并且在持续重复性TBI的患者中可能更严重。
本研究检测了具有mTBI病史的退伍军人的外周血和血浆中候选生物标记物的水平，并探讨其与慢性症状的关系。采用Simoa技术检测了神经丝轻链蛋白NfL、肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）和血管内皮生长因子（VEGF）在外泌体和血浆中的浓度水平。比较了上述候选生物标记物与PCS、PTSD和抑郁症状之间的关系；以及无创伤性脑损伤（对照组）、1-2次mTBI患者和重复性（3次或更多）mTBI患者的生物标记物水平。
样本
参与者被分为不同的TBI组进行分析，具体如下：（1）重复性（3次或更多）mTBI，（2）1-2
次TBI患者，和（3）对照组（无TBI史）。研究还比较了有或无爆炸暴露的受试者，以及伴有意识丧失/创伤性遗忘（LOC/PTA）的mTBI患者与只有意识改变（AOC）没有LOC/PTA的mTBI患者之间的比较。
研究方法
01、PCS、PTSD和抑郁症症状的评估
采用神经行为症状量表（NSI）评定PCS症状严重程度；使用创伤后应激障碍检查表军用版（PCL-M）评估PTSD的症状；抑郁症状采用9项患者健康问卷抑郁量表（PHQ-9）评估。
02、血样收集和蛋白质检测
生物标记物分析是在通过国际红十字会（IRB）批准的方案下进行的。检测血浆和从血浆中分离出的外泌体中的生物标志物水平。
03、从血浆中分离出外泌体
用ExoQuick法从含EDTA的冰冻血浆中分离出外泌体。
04、蛋白质定量
使用Simoa HD-1分析仪，检测NfL、IL-6、TNF-α、IL-10和VEGF在外泌体和血浆中的浓度水平并进行分析。所有待检物的浓度变异系数CV值（板内和板间）值均小于20%。
05、数据处理
本研究建立了包括人口统计学（年龄和性别）和临床TBI特征（TBI的数量、最后一次TBI距今年限、第一次TBI距今年限、由爆炸引起的TBI历史或相关的PTA或LOC症状）的广义线性模型（GLMs），以评估PCS、PTSD和抑郁症症状与生物标记物浓度水平之间的关系。
结论
01人口统计学和临床特征
195名受试者的人口统计学和临床特征如表1所示。与对照组相比，有TBI病史的个体表现出更严重的PCS、PTSD和抑郁症状。重复性TBI患者较仅有1或2次TBI的患者的PCS症状更为严重。重复性mTBI组患者中由爆炸引起的TBI的次数也显著高于1-2次mTBI的患者组。重复性mTBI组中，首次TBI后距今的年限较长；在1-2次mTBI组中，最近一次TBI距今年限较短。
表1：人口统计学和临床特征
02、重复性mTBI与生物标志物水平升高具有相关性
该研究比较了对照组、1-2次mTBI组和重复性mTBI组的生物标记物水平。观察到外泌体NfL和血浆NfL存在显著的组间差异。与对照组相比，1-2 次mTBI组和重复性mTBI组的外泌体和血浆NfL水平均升高。（表2）
03、TBI特征与生物标志物水平
TBI特征与生物标志物水平之间的相关性分析结果如图2所示。mTBI次数与较高的外泌体和血浆NfL以及血浆IL-6浓度呈正相关。此外，首次TBI后的年数与较高的外泌体和血浆NfL、血浆TNF-α、血浆VEGF浓度呈正相关。同样，自上次TBI以来的年数与外泌体NfL水平呈正相关。然而，IL-6水平随着时间的推移而下降，自上次TBI以来的年数与IL-6水平呈负相关。自上一次TBI以来，血浆NfL和血浆VEGF之间的相关性略为显著。
图2. TBI特征与生物标志物水平的相关性
04、生物标记物水平与PCS、PTSD和抑郁症状的严重程度有关
TBI症状与生物标志物水平之间的相关性结果如图3所示。NSI总分与外泌体NfL呈中度相关，与血浆NfL和血浆TNF-α轻度相关。研究还评估了每个NSI分量表（即躯体、情感、认知和前庭）与生物标记物水平之间的可能相关性。总的来说，外泌体NfL也与大多数NSI分量表呈中度相关。同样，血浆NfL水平与NSI躯体、认知、前庭和有效子量表中的较高分数呈正相关。躯体和认知子量表的高分与血浆TNF-α浓度降低呈弱相关。
此外，PCL-M评分与外泌体NfL水平呈中度相关，与血浆NfL和TNF-α水平呈弱相关性。PCL-M评分与外泌体IL-6浓度之间呈微弱相关性。PHQ-9评分与外泌体NfL和血浆NfL浓度水平相关。
为了评估生物标记物水平与NSI、PCL-M和PHQ-9评分之间的相关性，利用校正后的人口统计学和临床特征GLM模型（表3）进行分析。观察到较高的NSI、PCL-M和PHQ-9评分与外泌体和血浆NfL水平的增加之间的关联。
图3. TBI症状与生物标志物水平的相关性
表3. 行为症状的广义线性模型
小结
该研究结果表明，有mTBI病史的退伍军人，尤其是重复性TBI，其候选生物标志物（NfL、IL-6、IL-10、TNF-α和VEGF）的活性发生改变，这与慢性神经和行为症状相关。具体来说，在有重复mTBI病史的患者中，NfL的外泌体和血浆水平较高；NfL是轴突损伤的神经标志物，反映了反复mTBI后的慢性、持续性轴突变性或远端调节失调。外泌体和血浆中NfL水平的升高与PCS、PTSD和抑郁症状的严重程度相关；NfL水平的升高与首次损伤后的年数之间的相关性表明：轴突的持续和进行性调节失调可能是重复mTBI后慢性持续性症状综合征的关键。
研究还发现炎症标志物TNF-α和PCS和PTSD症状之间的相关性。本研究已经证明PTSD与外周血炎症细胞因子的升高有关，还表明慢性，特别是重复性mTBI与PTSD之间存在联系。这些发现有助于建立慢性mTBI持续性神经行为症状的预后生物标志物，并阐明mTBI后常见症状复合物的潜在机制。研究发现持续升高的神经和神经炎症标志物，包括mTBI总量和不断增加的症状负担之间的剂量依赖关系，可能为反复mTBI后持续症状发展的潜在发病机制提供了线索。
该项研究证明了这些容易获得的生物标记作物具有作为mTBI退伍军人行为改变的预测因子的潜力，并为潜在的病理机制提供了见解。
外泌体检测怎么可以没有Simoa？
近年外泌体研究热情持续高涨，外泌体最吸引人的是它能穿梭于细胞间，作为细胞间交互的桥梁。纵观国家自然科学基金外泌体资助细分领域，发现近年来资助较多的是外泌体中核酸水平的研究，如miRNA，lncRNA和circRNA等，这可能与核酸研究的技术比较成熟有关。然而，蛋白作为最终表达产物，外泌体蛋白研究领域也必将成为外泌体研究不可或缺的部分。以前，由于体液、细胞上清中含有外泌体的量很低，利用传统的Western
Blot、ELISA等方法满足不了低丰度蛋白的检测。现在，创新性的Simoa平台的出现弥补了检测技术的不足，将极大推动外泌体中蛋白成分的研究。
针对外泌体研究，SBC开发了一套完整的外泌体研究技术服务体系，提供从外泌体收集、鉴定到外泌体中核酸/蛋白提取、高通量筛选、生物信息数据分析、目的核酸/蛋白验证等技术服务项目。
