生物样本--细胞的提取
1.细胞的破碎
当待测组分(主要是各种多肽激素、各种酶以及各种基因工程的产物如胰岛素、生长激素等)存在于生物体细胞内及多细胞生物组织中时,需在分析测定之前将细胞和组织破碎,使这些待测组分充分释放到溶液中去,不同的生物体或同一生物体的不同组织,其细胞破碎的难易程度不一样,使用的方法也不完全相同。如动物胰脏、肝脏、脑组织一般比较柔软,用普通的匀浆器研磨即可,肌肉及心脏组织较韧,需预先绞碎再作成匀浆。植物肉组织可用一般研磨方法,含纤维较多的组织则必须在捣碎器内破碎或加砂研磨。许多微生物均具有坚韧的细胞壁,常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波和加压处理等方法。总之,破碎细胞的目的就是为了破坏细胞的外壳,使细胞内含物质释放出来,获得有效的提取。
除了上述一些方法外,目前人们仍在探寻新的多细胞破碎方法。下面介绍几种在实验室中常用的破碎方法
(1)机械法
机械法主要是通过机械切力的作用使组织细胞破碎,有以下几种装置和方法可用于组织细胞的破碎。
①高速组织捣碎机 由调速器、支架、马达、带杆刀叶、有机玻璃管(筒口加盖)等部分组成,操作时将样品配成稀糊状液,放置于筒内(约占1/3体积),固定筒上的盖子,将调速器拨至最慢处,开动马达后逐步加速至所需速度,一般市售商品转速最高可达20000r/min。高速组织捣碎机适宜于动物内脏组织、植物肉质种子、柔嫩的叶和菜籽材料的破碎。
②玻璃匀浆器 由一个内壁经过磨砂处理的玻璃管和一根一端为球状(表面经过磨砂)的杆组成。操作时,先把绞碎的组织置于管内,再套入研磨杆,手工来回研磨,或把杆装在电动搅拌器上,用手握住玻璃管上下移动,即可将细胞研碎。匀浆器的内杆球体与管壁之间一般只有十分之几毫米,细胞破碎程度比高速组织捣碎机高,机械切力对生物大分子破坏较少。制造匀浆器的材料除玻璃外,也可是不锈钢、硬质塑料等。
③研磨 常用的有研钵和研磨。细菌及植物材料应用较多,加入少量的玻璃砂效果更好。
(2)物理法
物理法主要通过各种物理因素的作用使组织细胞破碎,常用的有以下一些方法。
①反复冻融法 把待破碎样品冷至20-15℃使之冻固,然后缓慢融化,如此反复操作,大部分动物细胞及细胞内的颗粒可被破碎。
②冷热交替法 在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可使用此法。操作时,将材料放入沸水中,在90℃左右维持数分钟,立即置于冰浴中,使之迅速冷却,绝大部分细胞被破坏。
③超声波处理法 此法多用于微生物材料,处理效果与样品浓度及使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶时,常选用50～100mg/ml菌体,在1～10kMz频率下处理10～15min。
(3)化学及生物化学法
主要是通过化学试剂或酶破坏细胞壁而使细胞破碎,常用的有如下一些方法。
①自溶法 将待破碎的新鲜生物样品存放在一定pH值和适当的温度下,利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏,使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度,动物样品常选在0~4℃,微生物材料则多在室温下进行。自溶时,需加少量防腐剂如甲苯、氯仿等以防止外界细菌的污染。
②溶菌酶处理 溶菌酶可用蛋清或微生物发酵方法制得,具有专一地破坏细菌细胞壁的功能。如用噬菌体感染的大肠杆菌细胞制备DNA时,采用pH8.0、0.1mol/L Tris-0.01mol/L EDTA制成每毫升2亿个左右细胞的细胞悬液,然后加入100pg～1mg的溶菌酶,37℃ pH8.0条件下保温10min,细胞壁即被破坏。溶菌酶作用专一性强,适用于多种微生物,人们较喜欢使用。除溶菌酶外,蜗牛酶、纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞之用。
③表面活性剂处理法 较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。
除上述方法外,通过改变细胞膜透性,破坏蛋白质与脂类的结合,也可达到破坏细胞的目的,有利于蛋白质、酶等物质的分离提取。这方面应用较多的有真空干燥和用丙酮处理制成丙酮粉的方法。在酶的制备中,用丙酮干燥,不仅是使细胞膜破碎的有效方法,而且可做成具有酶活力的干粉长时间保存,作为一个很方便的原料样品在需要分析测定时以水或缓冲液把酶提取出来。无论用哪一种方法破碎组织细胞,都在一定的稀盐溶液或缓冲溶液中进行,一般还需加入某些保护剂,以防止生物大分子的变性及降解。
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