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低温保存对生物样本及其生物大分子的影响

2018.11.11

引言

生物样本库主要是指收集和应用健康及疾病生物体的生物分子、细胞、组织和器官等，包括人体器官、组织、体液或处理过的样本（DNA、RNA、蛋白等），以及与这些样本相关的临床资料、质控、管理等生物应用系统。

在医学研究中，生物样本是联系分子信息与疾病的桥梁。根据使用目的的区别，样本的保存要求也会有所差别。用于分子标记物提取的样本需要RNA、DNA、蛋白质等分子信息保存完好，保存过程中未发生降解。例如RNA 的RIN 值是评判RNA 质量的黄金标准，代表了RNA 的完整性。组织切片样本一般对生物大分子的保存效果不及冷冻，但是可以用于制备组织芯片，进行高通量的免疫组化、原位杂交、DNA、RNA 和蛋白质的定位分析及检测等实验研究。此外，病人的病史、病理记录还有术后的随访记录，都是转化医学研究的宝贵资源，为研究结果的分析提供合理必要的参考。保存使用记录，可以让使用者了解样本质量变化的可能诱因，有助于实现样本研究资源共享。生物样本库就是储存了各种样本及临床信息的一个机构或组织，为药物研发、个性化医疗等转化医学研究提供高质量的病理、保存和使用记录都完整的样本。样本的质量直接决定了研究结果的可靠性，样本保存和使用的每一个环节都直接影响样本的质量，如组织的冷缺血时间、样本的保存条件、保存时间、保存方法和使用管理等。

目前应用于生物样本库的保存温度有室温、4℃、- 20℃、- 80℃和液氮。

1) 室温: 一般室温可以保存固定的组织切片，但若要长期保存也应放入- 20℃; 用于提取RNA 的样本也可以用RNAlater在室温下保存。

2) 4℃: 可以短时间保存一些待处理的血液、DNA 等样本。

3) - 20℃: 较长时间保存提取的DNA 样本。

4) RNA、蛋白质、细胞和组织样本需要保存在- 80 ℃或者液氮中。

通常所讲的生物样本库主要保存的都是生物分子信息，并不要求样本保持活性。广义来讲，永生细胞库、脐血库、精子库等也可列入生物样本库的范畴，但是它们要求保存的样本能够用于再生或疾病治疗等目的，因此保存的样本要求具有活性，其所采用的技术叫做低温保存技术。

1 低温保存技术简介

1.1 低温保存的原理

在生物和医学范畴内，低温指从稍低于正常体温（37℃）到-196℃。低温能抑制生物体的生化活动，在此范围内，生命活动代谢速度随着温度的降低而降低，到达-196℃几乎完全停止。

生物体虽然在低温下可以长时间保存，却极容易在降温和复温过程中受溶液冻结、融化和溶液渗透压变化的影响而损伤。这种低温损伤主要发生在-60℃～0℃这段温度范围。为了避免这些损伤，使样本存活，需要在降温前加入适当的保护剂，并针对不同的保存对象设计特定的降温和复温程序。

1.2 低温保存技术的种类

所有的低于体温（37℃）的保存都可称为低温保存。而通常所讲的低温保存技术主要指为了保存活的细胞、组织和器官等，通过添加保护剂进行冻存的方法。主要有两种方法，一种是慢速冷冻低温保存法，另一种是玻璃化冻存法。

慢速冷冻低温保存法的具体步骤是: 先将细胞放在冷冻保护剂溶液中进行预处理，然后用程序降温仪以较慢的速度降温。细胞外溶液中水分结冰使溶液的浓度升高，胞内的水分渗出细胞膜，细胞体积收缩，胞内溶液浓度升高; 随着温度的降低，上述过程持续进行，到达一定的低温后，再快速降到液氮温度，并长期保存在此温度。此过程是传热和渗透两个因素相互作用的过程，因此对于每一个冷冻对象，都有一个最佳冷却速率使二者达到最好的配合。

玻璃化冻存法研究的重点是寻求容易实现玻璃化，并且对细胞损害较小的溶液和提高冷却速率。该法的具体步骤一般是将细胞置于高浓度保护剂溶液，然后迅速投入液氮。保护剂溶液的配方、投入液氮前的平衡程序及复温洗脱程序是研究的关键。

1.3 低温保存技术的应用

目前，低温保存技术主要应用于细胞、组织和器官的低温保存，如干细胞、血红细胞的保存，精子、卵母细胞的保存，胚胎、皮肤等组织的保存等。目前样本库以保存分子标记物为目的，还是使用直接冻存法保存样本，本课题组正在试验研究低温保存技术在生物样本库的应用。

1.4 低温保存技术存在的问题

低温保存技术虽然可以使细胞、某些组织和器官等保存成活，但是仍然存在一些亟待解决的问题: 主要是低温保存引起的结构及功能上的损伤和改变，还有其蕴含的生物分子信息也有可能发生改变; 其次低温保存对场地、设备、资金和管理方面的要求比较高等也是该技术应用面临的问题。

2低温保存对样本的影响

生物样本库中用于提取生物大分子的组织样本一般直接投入液氮，并储藏在液氮或者- 80℃冰箱。目前认为低温下基本不会发生生物大分子的降解，样品可以用于各种分子检测。但是，由于RNA 与蛋白质的不稳定性，长时间保存也可能带来不同程度的降解。

添加低温保护剂保存可以使细胞保持活性，但是由于冰晶损伤、渗透压损伤及保护剂等外来物质的添加，不可避免会给细胞带来一定程度的损伤。这些损伤可以是形态上的，也可以是功能上的，还可以是细胞内生物大分子的降解或突变等。

2.1 低温对细胞、组织形态结构及功能的影响

在低温保存过程中，由于冰晶的形成和渗透压的改变，会引起细胞膜的受损和皱缩，进而也会导致细胞、组织形态和功能发生改变。而样本库目前采用的直接冻存法会破坏细胞膜，使细胞和组织丧失正常的功能。实验表明，通过改进保护液的配方和冷冻保存的方法，可以减少低温带来的形态结构及功能上的损伤。

2.2 低温对生物大分子的影响

低温保存技术对生物大分子的影响直接决定了该技术能否应用于生物样本库。只要生物样本置于低于正常生理温度的环境下，都会对细胞产生寒冷刺激，这种来自外界的刺激会对细胞正常的生理代谢产生影响，从而影响生物大分子的质量或表达，只是由于温度高低和时间长短的不同，影响大小会有差异。从分子水平来看，冷冻对膜磷脂、蛋白质和核酸的影响是通过改变疏水和亲水反应决定的结构实现的。

2.2.1 低温对DNA 的影响

对生物样本中DNA 的关注集中在基因信息的完整性与突变，目前认为直接冻存法能比较好地保存DNA 信息。根据储藏对象的不同，直接冻存法对DNA的影响还是存在差异的。

2.2.2 低温对RNA 的影响

直接冻存法与冻存时间对RNA 的影响研究也是主要集中在完整性上，普遍认为保存较长时间后会发生降解，并且和保存对象的特征有关。

2.2.3 低温对蛋白质的影响

低温对蛋白质的影响比较大，有针对酶功能、二级结构、表达量等多方面的研究，多数认为低温会对蛋白质带来一定的影响。

一些蛋白质可能会在很低的温度下（小于- 80℃）保持活性。因此，当生物样本贮存在水还具有流动性且蛋白也具有活性的温度下时，也会导致其降解。

2.2.4 低温对脂类的影响

脂类物质作为生物标记物用于分子诊断等检测的主要是游离脂肪酸。细胞膜主要是由双层磷脂膜构成，当希望保存完整细胞结构时就必须考虑低温对脂肪带来的影响，并且冷冻造成的脂类物质的变化可能会导致细胞生存环境的变化。冷冻会改变脂肪的物理状态，从而改变其组织结构和流动性，因此细胞膜的磷脂双分子层结构会发生变化。

3 低温保护剂的保护作用

3.1 低温保护剂对细胞、组织、器官结构和功能的保护作用

在冷冻保存时加入低温保护剂可以抑制冰晶的生成，从而减少冰晶对细胞结构的破坏，维持细胞的正常功能。