由转座子插入引起的基因突变
实验概要
本实验介绍了由转座子插入引起基因突变的原理和实验方法。
实验原理
转座子（Tn）是能在不同复制子之间转移位置的核苷酸顺序。它一般来自抗药性质粒，由一个或几个抗药性基因加上两端两个顺序相同（但是方向不一定相同）的核苷酸片段（称为插入顺序IS）构成。当一个转座子转移位置而插入某一基因时，能使这一基因失活，即发生突变。各个转座子的抗药性基因、转移频率、插入位置、插入顺序都可以不同。有些转座子对于染色体的各个位置插入没有偏向，而另一些则偏向于插入某些特定的位置。
转座子的插入突变有两上表型效应，即基因突变的表型效应和由转座子带来的抗药性。因此利用转座子可以有效地取得任何一种突变型。一个很有效的方法是通过转座子诱发F’因子上的染色体基因的插入突变。
大肠杆菌2－2菌株的染色体上携带有Tn5转座子（含kan抗性基因）。要使Tn5插入到F’ Lac Pro /Strs的乳糖发酵基因中去以引起Lac 突变，可先将这一F’因子转移到Δ(Lac Pro)Strr受体细胞中去，再观察是否发生了插入突变。在能排除供体的含链霉素的培养基上选择Pro 受体菌落，若是抗卡那霉素的，那就是说受体细菌不但接受了F’因子，而且这一F’因子带有Tn5，如果它又由Lac 变为Lac-,不能在以乳糖为唯一碳源的培养基上生长，那么，这一插入位置就是在乳糖发酵基因中。
为进一步提高效率，还可以采取一种措施，使在特定条件下Lac 细菌不能生存而Lac-细菌能够生存。已经知道galE突变型在有乳糖和半乳糖存在的情况下，由于细胞中积累有毒的半乳糖代谢中间产物UDP－gal和gal-1-P而死亡，所以如果采用galE突变型作为受体细菌，在含有0.02%乳糖和0.2%甘油的基本基上，受体细菌如果接受了一个F’Lac Pro ，就不能生存。如果lac 基因由于插入了Tn5而成为lac ,那么受体细菌便能生存下来。
主要试剂
1. LB完全培养液，每组4支，每支5ml。
2. 无菌生理盐水，每组6支，每支4.5ml。
3. L选择培养基：含链霉素、卡那霉素、乳糖和甘油的基本培养基，每组6皿。
4. G选择培养基：含链霉素和葡萄糖的基本培养基，每组5皿。
主要设备
1. 37℃摇床
2. 250ml三角瓶
3. 培养皿
4. 超净工作台
实验材料
1. 受体菌：F-/Δ(lac proB) gaE strr。
2. 供体菌：F’lac pro /Δ(lac pro)nalr带Tn5于染色体某处。
实验步骤
1. 第一天傍晚，分别接一环供体菌和一环受体菌于两支5ml LB培养液中，37℃摇床上培养过夜。
2. 第二天，取两个内含4ml LB培养液的250ml三角瓶，分别加入1ml过夜培养的供体菌及受体菌，在37℃摇床上培养2-3小时。
3. 将新鲜培养的供体菌及受体菌各取1ml，在一无菌的250ml三角瓶中混合，37℃轻摇60分钟。
4. 吸取0.5ml混合菌液，用生理盐水稀释10-6倍。
5. 从10-1倍稀释液中吸取0.1ml涂于L选择培养基平板上，将供体菌及受体菌分别吸取0.1ml涂于L培养基上作为对照。再从10-2、10-3、10-6倍稀释液中各吸0.1ml分别涂于G培养基平板上。37℃培育二天。
6. 观察、统计并计算：
1) 接受了供体F’(Lac Pro )的受体菌的数目：G板上生长的菌落数(个/ml)。
2) 在L板上生长的菌落数（个/ml），即Tn5插入到lac基因上菌落数。
3) 计算Tn5转座到lac Z或lacY上的转座频率，在L板上生长的菌落数/在G板上生长的菌落数。
