胸腺DNA的制备
实验概要
本实验介绍了浓盐法小牛胸腺DNA制备的原理及操作步骤。
实验原理
DNA在生物体内是以与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核酸蛋白复合物（DNP）后，必须将其中的蛋白质除去。小牛胸腺，鱼类精子和植物种子的胚等含有丰富的DNA，可作为提取DNA的良好材料。动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠溶液），但在0.14mol/L盐溶液中的溶解度很低，而核糖核蛋白（RNP）则溶于0.14mol/L盐溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白以及其他杂质分开，当核蛋白与氯仿一起振荡时，蛋白质变性而与核酸分开，核酸继续保留于水相中，再用乙醇将水相中的DNA沉淀出来。为除去DNA制品混杂的RNA，可用核糖核酸酶处理。大部分多糖在用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去，如需要还可以进一步通过柱层析或电泳加以纯化。
主要试剂
1. 0.1mol/L氯化钠-0.05mol/L，pH 7.0柠檬酸钠缓冲溶液：先配制0.05mol/L，pH=7.0柠檬酸钠缓冲溶液，然后将氯化钠溶于此缓冲溶液中，使其最终浓度达到0.1mol/L。
2. 10%氯化钠溶液；
3. 氯仿-异戊醇混合液（体积比为9∶1）；
4. 95%乙醇及无水乙醇。
主要设备
1. 组织捣碎机
2. 离心机
3. 玻璃匀浆器
实验材料
小牛胸腺
实验步骤
1. 取新鲜（或冰冻）的小牛胸腺，除去血水和结缔组织，在冰浴上切成小块，称取20g，加入2倍体积的0.1mol/L氯化钠-0.05mol /L，pH=7.0柠檬酸钠缓冲溶液，于组织捣碎机上高速匀浆5分钟。
2. 组织糜用转速为3000r/min的离心机离心15分钟，将沉淀用50 mL上述缓冲溶液洗涤2次，洗涤时用匀浆器研磨洗涤，每次如前离心。向最后得到的细胞核沉淀中加入6倍体积的10%氯化钠溶液，充分搅匀置冰箱中过夜，以充分提取DNP，溶液为粘稠状。将所得的半透明粘稠状液体，用滴管慢慢注入冷蒸馏水中，边加边轻轻搅动（NaCl的最终浓度为0.14mol/L），这时有白色丝状物-核蛋白析出，在冰箱中静置数小时，收集沉淀。将沉淀物再溶于4倍体积的10%氯化钠溶液中，迅速搅拌以加速溶解。加入1/2体积的氯仿- 异戊醇混合液，剧烈振荡5分钟左右，用转速为3000r/min的离心机离心15分钟，得三层：上层为含有DNA和DNA核蛋白的水层，下层为氯仿-异戊醇的有机溶剂层，变性蛋白质介于两层之间。
6. 吸出上面的水层，再用氯仿-异戊醇如前进行脱蛋白，直至界面处不再出现变性蛋白质为止。
7. 最后吸出上清液并将其注入两倍体积的95%乙醇中，用玻璃棒搅起白色纤维状DNA沉淀，沥干，用80%乙醇洗涤，最后用少量无水乙醇洗涤。尽量沥干乙醇后，铺开在表面皿上。置于真空干燥器内干燥，即得白色纤维DNA钠盐。
注意事项
1. 由于DNA主要存在于细胞核中，为了便于提取DNA，应严格控制胸腺破碎的条件，既要将细胞膜破碎，又要尽可能避免细胞核被破坏，导致DNA释放而被断裂。
2. 在用氯仿-异戊醇除去组织蛋白时，要剧烈振荡使蛋白变性。若振荡不够，蛋白质不能很好除去，则影响DNA制品的质量
