大鼠转化生长因子-a(TGF-a)ELISA检测法
大鼠转化生长因子-a(TGF-a)ELISA试剂盒
原理
本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 TGF-a 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 TGF-a与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠TGF-a，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，TGF-a浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中TGF-a浓度。
试剂盒组成（2-8℃保存）
酶标板（Coated Wells） | 96孔 | 酶标抗体工作液（Enzyme Conjugate） | 12ml |
10×标本稀释液（Sample Buffer） | 12ml | 20×浓缩洗涤液（Wash Buffer） | 50ml |
标准品（Standards）：2ng/瓶 | 2瓶 | 底物工作液（TMB Solution） | 12ml |
第一抗体工作液（Biotinylated Antibody） | 12ml | 终止液（Stop Solution） | 12ml |
准备试剂与收集血样
1. 收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆、尿液、牛奶等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。
2. 标准品液配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成4000pg/ml的溶液。设标准管8管，每管加入标本稀释液200ul。在第一管中加入4000pg/ml的标准品溶液200ul混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出200ul弃去。第八管为空白对照。
3. 10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。
4. 洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）
标本激活方法
1. 将450ul标本稀释液加入到一支1.5ml进口聚丙烯管中,再加10ul血清或血浆标本。
2. 加20ul 1 N HCI,盖紧，上下混匀。2－8℃放置60± 2分钟。
3. 加20ul 1 N NaOH,盖紧，上下混匀。
4. 即用，或放-20/-70℃保存3天。计算结果时乘以稀释倍数50。（注意：不同的标本TGF-a的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度）
5. 细胞培养上清或组织匀浆10倍稀释(410ul的标本稀释液＋50ul样本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。
6. 尿液直接活化1.4倍稀释（100ul尿液＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH）
检测程序
1. 加样：每孔各加入标准品或待测样品（已激活）100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
3. 每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。
8. 每孔加入100ul终止液混匀。
9. 30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
结果计算与判断
1. 所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2. 以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。
3. 根据样品OD值在该曲线图上查出相应TGF-a含量，再乘上稀释倍数即可。
试剂盒性能
1. 灵敏度：最小的TGF-a 检测浓度小于15pg/ml。
2. 特异性：可同时检测重组或天然的大鼠TGF-a。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。
3. 重复性：板内、板见变异系数均小于8.9％。
注意事项
1. 以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。
2. 洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。
3. 板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。
4. 本试剂盒宜置4oC冰箱保存。
5. 本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！
