ELISA法检测的影响因素及其对策（一）
酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前临床实验室检测免疫学指标最受欢迎、应用范围最广泛的方法之一，广泛应用于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病以及结核等传染类疾病的诊断及激素的检测，具有灵敏度高、特异性强、快速简便、重复性好、成本低、环保且适合大批量人群筛查等优点，虽然操作简单，但是一些影响因素不容小觑，临床待检标本常受溶血、黄疸、脂浊、类风湿因子、高浓度非特异性免疫球蛋白、药物、血液抗凝剂及细菌污染等因素的影响，导至检测结果判断错误。
酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一种特殊的试剂分析方法，在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，其试剂易于保存、结果判断较为客观，是目前实验室检测抗原抗体最经济、最普遍的试验诊断方法。其原理是将抗原(抗体)结合到固相载体表面，再将待测抗体(抗原)、酶标抗原(抗体)与固相抗原(抗体)结合形成免疫复合物，经洗涤使免疫复合物与待测抗体(抗原)呈比例，加入酶反应底物使其与固相上的酶反应变色，根据颜色做定性或定量分析，得出检测结果。ELISA 法步骤包括标本的采集、保存、加样、温育、洗板、显色、比色以及结果判断，临床采集待检样本过程中常出现溶血、黄疸、脂浊，类风湿因子、高浓度非特异性免疫球蛋白、药物及血液抗凝剂等亦对结果产生一定影响。虽然操作简单，但还是需要注意一些因素的影响，试剂的选择、正确的操作、优良的仪器都与检测结果密切相关。本文根据样本的影响因素及操作流程中可能出现的相关问题展开笔述，对ELISA法检测的影响因素及相应对策作一综述，希望提高ELISA法检测的准确性。
一、样本的影响因素
临床采取空腹抽取静脉血清作为 ELISA 检测标本，标本采集过程中很多因素可能导至检测结果不准确，如溶血、脂浊、类风湿因子、甲胎蛋白、高浓度非特异性免疫球蛋白、药物、血液抗凝剂及细菌污染等。
1.1 溶血
溶血时红细胞破裂释放出具有过氧化物酶活性的物质干扰试验结果出现假阳性，孙辉等通过实验报道样品溶血血红蛋白浓度不大于4.95g/L，对双抗原夹心法、间接法、竞争法、捕获法检测结果均无影响。徐传国认为溶血易导至弱阳性标本漏检，黎学东等认为虽然溶血会对 HB-sAg 检测造成假阳性影响，但是小于 8g/L 时可以检测；王红等使用不同的干扰物浓度及分析方法得出结论，随着溶血程度的增高 HBsAg 检测OD值有轻微增高趋势；但是溶血检测抗-HIV 无影响。
临床工作中无法采集到无干扰物血清或因操作因素导至标本出现溶血时，评估标本干扰物含量及标本处理情况，在有效范围内进行ELISA检测，对于溶血标本可先测定血浆 Hb 含量，不大于5g/L 时可用于 HBsAg 的检测，超过此范围的阳性标本最好做复检，避免假阳性结果发生。目前也有通过增设试验孔的方法来处理轻度甚至重度溶血标本的检测，使溶血造成的假阳性结果得到纠正，且有非常显著性统计学意义。
1.2 脂浊
孙辉等通过实验报道乳糜样品含福尔马肼浊度小于 1460FTU 的乳糜时，对双抗原夹心法、间接法、竞争法、捕获法的检测结果均无影响。汪建国等认为脂质颗粒会黏附在反应孔内壁，使吸光度 A 值增高出现假阳性；徐学新等认为不同程度的乳糜血液随着放置时间的延长 OD 值下降，导至不同程度的漏检。虽然可采取高速离心的方法可将乳糜微粒去除，此过程可能对检测结果带来影响，然而盲目采取高速离心等方法试图去除干扰物并不可取。
1.3 黄疸
结合胆红素浓度不大于 344μmol/L 对双抗原夹心法、间接法、竞争法、捕获法的检测结果均无影响，超过浓度的样本应重新采集，对于黄疸病人为保证检测结果的可靠性可选择其他检测方法。
1.4 类风湿因子
在类风湿患者及健康者血清中常含有类风湿因子 (RF)，RF 为一种抗人或动物变性免疫球蛋白 IgG 的自身抗体，与 IgG 分子 Fc 片段抗原决定簇结合，常见的有 IgM、IgA、IgG、IgE型，均能与变性 IgG 抗体产生非特异性结合，在ELISA 检测抗原的试剂盒中，RF 可与固相包被的表面抗体的 Fc 片段及酶标记物中免疫球蛋白结合。研究表明高浓度的类风湿因子可引起 ELISA检测抗原检测出现假阳性结果，类风湿因子可与固相上包被的特异性抗体 IgG 及随后加入的酶标特异性抗体 IgG 结合出现假阳性结果。穆海霞等研究报道高浓度 RF(＞500IU/ml)对 ELISA 检测HBsAg 产生假阳性结果较明显，且与 RF 浓度无显著相关性。
在临床工作中，若出现乙肝两对半少见模式，如仅 HBsAg 阳性，应结合患者病史并采用其他方法如微粒子酶免疫法进行复检，慎重报告。
1.5 抗体、补体
人类血清中含有天然异嗜性抗体，而异嗜性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗产生假阳性结果。来自哺乳动物的固相抗体及酶标二抗可激活人体补体系统，在反应过程中抗体分子结构发生变化，暴露补体的结合位点，产生假阳性结果，也可能固相抗体因为活化补体的结合导至抗原抗体的表位结合能力下降，出现假阴性结果。研究报道高浓度的乙型肝炎表面抗体会引起 HBsAg 检测出现假阴性结果，临床需注意避免携带污染造成检测结果错误。
1.6 血液保存液
志愿者献血一直是各医院血站血液的主要来源方式，低浓度标本的检测对输血安全至关重要，按照《献血者健康体检要求》和《血站实验室质量管理规范》，献血者需检测抗-HIV、抗-HCV、HBsAg、梅毒抗体等，且必须建立初次有反应标本的复检程序，常采用抗凝试管血和采血导管血同时复检，然而不规范的操作常导至试管标本和末端血袋管混入血液保存液。血液保存液成分、pH值、离子强度等影响均可能导至检测结果错误。血液保存液对 ELISA 法检测抗-HIV 结果影响明显，能明显减低试剂对抗-HIV 的检测能力，造成假阴性结果；也有研究报道，血液保存液对HBsAg、梅毒抗体、ALT弱阳性试管标本及血袋管标本检测结果影响有统计学意义，造成弱阳性结果漏检，但对抗-HIV 阳性结果检测无影响；张桂芳等通过实验证明抗凝剂对 HIV 阴性抗体检测结果无影响，但是当抗凝剂高于 5mg/ml 时对 HIV阳性测定造成明显负干扰，同时也影响血细胞分析，且同一抗凝剂同一浓度对不同公司的试剂检测 HIV 抗体影响也不相同。
血液保存液是必须使用的，可以通过以下方法避免血液保存液带来的不良后果：完善标本留样确认程序，确保标本与血袋同源，采用试管标本代替血袋标本，避免从血袋导管采取复检标本；采用新型留样血袋，附带留样试管，将最初采集时未混入血液保存液的血液用于检测；规范血液留样操作，防止待检标本混入血液保存液，若混入，可将抗-HIV 的临界值相应调低。如果使用 EDTA-K2做抗凝剂，最好将浓度控制在1.5~2.5mg/ml 的范围内，对于较难采集到足够血液样品的患者可采用血细胞分析检测HIV 抗体。如采用抗凝血将做检测样本时最好与血清样本进行对比试验，并建议厂家对试剂的干扰能力进行严格的质量控制，说明适合使用的试剂及其相应浓度。
1.7 药物
研究表明，高效价乙型肝炎免疫球蛋白可以和 HBsAg 形成免疫复合物，使HBsAg 阳性患者检测呈阴性，出现两对半少见模式；部分 HBsAg阴性者接种乙肝疫苗1~2 周后血清中可检测到HBsAg，造成 HBsAg 一过性阳性，所以乙肝疫苗接种后一个月内最好避免做乙肝两对半检查。
1.8 细菌
一些细菌的菌体中可能含有内源性过氧化物酶会对使用相应酶做标记的测定方法产生影响，污染细菌可能含有内源性辣根过氧化物酶，使试剂出现非特异性显色造成假阳性而干扰结果。
1.9 样品因素小结
综合得出，在正确的时间采集标本并防止污染、避免破坏，在干扰物处于一定浓度范围内(胆红素浓度≤344μmol/L，溶血血红蛋白浓度≤4.95g/L，乳糜样≤1460FTU)进行 ELISA 四种方法检测均不影响检测结果，但对竞争法检测HBeAb 的影响有统计学意义。对于贫血性溶血、新生儿溶血性黄疸及抽血不当等造成的溶血标本尽量避免二次抽血对病人造成不必要的伤害。
