eccDNA新型生物标志物的多种应用
实验方法：eccDNA-seq
文章内容
1. 血浆中eccDNA检测
eccDNA高通量检测的关键步骤是要通过实验手段对其进行有效的富集。研究者通过线性DNA的去除、eccDNA的纯化、建库、测序，生物信息分析对反式剪切位点（junction site）的识别从而完成对eccDNA的鉴定。5例孕期女性的血浆样品中eccDNA的富集与高通量测序结果显示：1）核酸外切酶V（exoV）去除线性DNA的过程对eccDNA的富集效果非常明显；2）同一个体血浆中的eccDNA与线性DNA相比最显著的特征在于长度分布。线性DNA长度在166bp左右富集，而MspI方法纯化的eccDNA主要在202和338bp处有明显集中，并且338bp处的eccDNA数目要明显多于202bp附近的eccDNA个数。
图1 线性DNA和eccDNA长度比较
2. 胚胎源和母源eccDNA检测比较
之前的研究结果显示胚胎源（fetal origin）和母源（maternal origin）血浆中线性DNA分子在长度分布不同，通过SNP的方式对eccDNA分子进行来源分类，结果显示5例孕期女性个体的eccDNA长度均在约202bp和约338bp两个地方有明显富集，但是总体来讲累积分布曲线显示胚胎源eccDNA长度分布总体位于左侧，换言之胚胎源的eccDNA长度要短于母系eccDNA，这种趋势和两种来源线性的DNA长度的差异趋势保持一致。
图2 eccDNA长度分布和来源多样性
3. eccDNA的片段化方法优化
此项研究当中使用的MspI处理方法有一个缺陷，就是MspI总是识别酶切位点的特征序列CCGG，这种识别模式对于长片段eccDNA更有利，因为该分子更有可能含有CCGG序列，利用Tn5随机剪切的特性能够有效的解决这一问题，极大的提高eccDNA的检出。数据分析结果显示胚胎源eccDNA长度主要分布在202bp和338bp附近，相比于母源eccDNA，胚胎源的分子长度相对较短。
图3 eccDNA MspI和Tn5剪切效果对比
4.母体血浆中eccDNA基因组注释
母体血浆当中的eccDNA分子主要来源于5’UTR区，外显子区以及CpG岛，在Alu原件相对较少。这一分布规律和小鼠组织、非孕期人群血浆当中的eccDNA分布保持一致。eccDNA的来源位置并非完全随机，而是具有一定的偏好性，但母源和胚胎源的eccDNA分布无明显统计学差异。通过比较eccDNA反式剪切位点发现，少数剪切位点（322，0.018%）在5例孕期个体当中都被检测到。
图4 eccDNA的染色体分布
5. eccDNA形成位点的motif探索
eccDNA的反式剪切位点附近是否有motif特征性序列可以阐释eccDNA的成环机制？文章中对成环片段的上游和下游序列进行了进一步讨论，剪切位点上下游各50bp左右的位置的motif分析结果明确了4bp的“空间隔板”，文章中把这种模型描述为“重复模式（recurrent pattern）”。在S1、S2两侧分别由四个重复区域，1区和3区序列相同，2区和4区相同，计算机模拟显示出现这种模式的概率是0.056%，而测序结果当中为3.484%，这种模型非常有利于同源重组和微同源介导的末端剪切，而这一现象也符合经典的eccDNA成环机制。
总结
本篇文章聚焦孕期女性血浆当中的eccDNA检测。不同于线性DNA，eccDNA长度更长，母系来源的eccDNA比胚胎来源的eccDNA分子长度也更长。成环位点上下游的信息有效的提示了可能的eccDNA形成机制，为接下来eccDNA的进一步研究奠定基础。这些成果都有利于推动eccDNA在液体活检以及生物标志物方面的应用。
2020年年初的寒潮并不能冰冻eccDNA在科研界的火热。重量级期刊的文章发表已经为我们一年的科研指明了方向，游走在线性DNA之外的eccDNA将是生物医学领域最闪亮的星。新分子，新方向，机遇与挑战并存，运气与实力同在，祝愿各位生物医学的工作者在新的一年能抢占先机。
