Cell | RANKL刺激下破骨细胞的命运追踪
骨骼提供支架来支撑体重，确保身体运动，保护重要器官，控制矿物质稳态，同时也为造血提供位置。骨骼是一个动态更新的器官，在整个生命周期内，骨骼会持续重塑。破骨细胞吸收旧骨，成骨细胞形成新骨，两者在时间和空间上的协同作用，参与调节骨骼的重塑。破骨细胞是由单核细胞/巨噬细胞造血谱系前体细胞融合形成的特殊细胞【1】，在骨稳态和人类健康中有重要作用，破骨细胞形成和功能的失调参与佩吉特病、骨质疏松症、类风湿性关节炎和转移性癌症等病理过程。
骨骼具有不透明、折射率高的特点，很难对活体动物的骨细胞成像。研究显示维生素D和甲状旁腺激素存在下，骨髓细胞培养可产生破骨细胞样细胞，可构建体外研究系统。体外研究揭示了破骨细胞的细胞起源以及破骨细胞形成和功能所需的因子，例如M-CSF、RANKL等。同时，双膦酸盐、雌激素和机械力等刺激下，破骨细胞可能发生凋亡。总的来说，破骨细胞是终末分化的细胞，在2周的短暂寿命后发生凋亡。然而，最近的一项研究表明破骨细胞寿命更长，约为6个月【2】。双光子显微镜通过近红外波长的荧光激发成像，可深入活体组织内部，已用于对破骨细胞前体细胞、破骨细胞骨吸收和破骨细胞-成骨细胞相互作用等进行成像。这些研究是通过观察颅骨（膜内骨化形成的不承重的扁平骨）中细胞进行的，这种细胞可通过颅骨短缝中的缝隙成像。但是，迄今为止还没有研究对软骨内骨化形成的负重长骨中破骨细胞的形成和命运分化进行成像。
近日，来自澳大利亚加文医学研究所的Peter I. Croucher团队和新南威尔士大学医学院的Tri Giang Phan团队合作在Cell杂志上发表题为Osteoclasts recycle via osteomorphs during RANKL-stimulated bone resorption的文章，该研究对胫骨进行成像，发现RANKL刺激的破骨细胞有另一种细胞命运，分裂成称为osteomorphs的子细胞。抑制RANKL可阻断这种细胞循环，导致osteomorphs的累积。scRNA-seq显示，osteomorphs在转录上不同于破骨细胞和巨噬细胞，并表达一些非典型破骨细胞基因，敲除这些基因导致小鼠产生骨结构和功能相关的表型。此外，人类同源的osteomorphs基因发生的遗传变异可导致单基因骨骼疾病，并与多基因骨骼特征——骨密度相关。
首先，作者利用分别表达绿色（Blimp-1Egfp/+,Rag-1-/ -或 Csf1rEgfp/+）和红色（Lysmcre/+, TdtomatoLSL/LSL）荧光蛋白的骨髓细胞重建小鼠的骨髓系统，破骨细胞由于是单核细胞/巨噬细胞谱系融合而成，所以同时表达红色和绿色。在小鼠的胫骨中，LYSM+BLIMP1+或LYSM+CSF1R+细胞被鉴定为破骨细胞，其邻近骨内表面。双标记细胞具有多核，表达组织蛋白酶K（破骨细胞表达的一种关键酶），且>90%的细胞可从骨中再吸收双膦酸盐，证实它们是破骨细胞。这些细胞与体外产生的破骨细胞具有相似之处，但它们有特殊的星状外观，多个细胞突起与相邻的细胞接触，形成一个相互连接的网络。超过2小时的活体成像显示，这些破骨细胞在稳定状态下的大小、树突形态和定位都具有稳定性。
体内和体外的实验都显示，可溶性RANKL刺激的破骨细胞具有高度的动态性，经历形态变化，激活的破骨细胞相互迁移，出现细胞融合，形成较大的细胞。长时间的成像观察发现，较大的sRANKL刺激的破骨细胞常常分裂成较小的子细胞，这些子细胞直径大于5μm，可自由移动，且裂变没有伴随着破骨细胞与巨噬细胞互作水平的变化。该现象在体外也观察到。经过比较，破骨细胞的裂变与凋亡过程不同。追踪显示，裂变的子细胞（称为osteomorphs细胞）不仅可从母体多核体中迁出，而且可与邻近的破骨细胞融合，甚至可相互融合，实现破骨细胞的循环。稳态条件下，不能观察到破骨细胞的循环；sRNAKL处理小鼠导致破骨细胞裂变、融合，时长可达7h；OPG：Fc抑制RANKL信号则抑制破骨细胞的循环；但OPG：W消除RNAKL信号抑制3周后，仍然可观察到破骨细胞的循环，且OPG：W增加循环的破骨细胞，其比例达到与sRANKL刺激类似。即破骨细胞的循环受到RANKL信号的调控。进一步观察发现，OPG：Fc处理抑制了RANKL依赖的融合过程，导致osteomorphs积累。小鼠经历OPG：Fc处理2周，OPG：W处理15周。发现OPG：Fc长时间处理导致小鼠血清TRAP 5b降低，OPG：W处理则恢复；同时，骨密度最初增加，8周达到峰值，随后下降；这些变化与骨微结构的变化平行。
进一步研究证明，破骨细胞分裂的osteomorphs可进行细胞融合，形成多核细胞，吸收骨，摄取双膦酸盐。分离osteomorphs细胞进行测序分析，发现转录水平上，osteomorphs细胞与破骨细胞和巨噬细胞不同。在osteomorphs中上调的基因中，其中40个基因有敲除小鼠品系，其中17个有骨结构和/或功能上表型，例如Cadm1、Lmna、Leprot、Myo7a、Nsun2、Slco2b1都在骨骼中具有重要作用。寻找osteomorphs基因的人类同源基因并进行分析，发现osteomorphs基因可导致单基因骨骼疾病，其中一些基因与骨密度密切相关，表明osteomorphs基因在罕见的单基因和常见的多基因骨骼疾病（如骨质疏松症）的发病机制中都起作用。
总的来说，研究追踪了破骨细胞的分裂和融合过程，揭示出一个新的细胞群——osteomorphs，其转录组不同于破骨细胞和巨噬细胞，且具有融合特性、可运动、可形成破骨细胞参与骨吸收调控，或是治疗骨骼疾病的潜在靶点。
