核酸适配体筛选实验的难点在哪里
首先它确实是比较难，但是SELEX实验的难和其它实验的难是不太一样的。像做单分子成像，或者某些超灵敏的检测类的实验，很多时候受制于我们的客观条件，受制我们所拥有的仪器设备。可是，核酸适配体的筛选与这些实验不同，因为SELEX实验它所用的仪器设备条件其实都非常简单，几乎所有的分子生物学实验室都具备。那么问题就来了，它的难到底难在什么地方？为什么看似简单的实验，大家会觉得很难呢？【当然，我也觉得挺难的】
我最开始接触SELEX实验的时候，我也不认为它难，直到做了几年之后，啥也没筛选出来的时候，才发现它真的不像我之前想象的那么简单，并不仅仅是那么几个简单的分子生物学实验完成了就可以的。它的难到底难在什么地方呢？不是难在这个实验操作上有多难，而是难在我们对这个实验的理解上。
关于筛选难这一点，我认为是大家可以想象到。如果说这个实验真的那么简单的话，那么为什么那么多人筛选不出来呢？不就是那么几个简单的分子生物学实验吗？所以这里面一定有它的原因。而这种原因，恰恰难在很大程度上，这种原因到现在还是未知的。也就是说，我们不知道为什么失败了，这才是真正难的地方。如果说我们知道我们为什么失败，由什么原因导致失败，那么我们去克服就可以了，我相信凭中国现在的实力，中国的研究条件和中国人的智慧没有什么能够难倒我们的。但是为什么这个事情让我们觉得很难，因为我们不知道，我们不明白，我们不理解其中的原因。
下面我想先说说，从我们实验室来说，我们觉得它难在什么地方？
核酸适配体筛选，其实可以分成两个大的部分，第一个部分主要是重复性的操作，一轮一轮的筛选实验。就是结合、分离、PCR扩增、单链制备、再筛选等等这样一个循环过程。我认为这部分实验对我们实验室来说，这部分不是大问题，我们能够保证正确的进行，而且这个时间的话，通常来说，如果是筛选一个单一的靶标，不管是小分子还是蛋白，我们基本上能够在两周之内完成全部筛选。如果稍微加快一些的话，基本可以在一周之内完成筛选过程。
对于我们来说，目前的难点在什么地方呢？主要是难在后期的鉴定。我们可以想象一下，在前面的筛选过程当中，我们可以从10的15次方的文库当中，找到那么几千条、几万条、或者几百条不同的序列构成的一个文库，这个文库如果是有亲和力的，说明前面筛选是成功的。但是获得这个文库之后，并不代表我们实验就已经成功了，我们还需要从这样一个文库当中去找到真正能够结合的单一序列，所以这个时候我们就要去做下一步的工作，需要去做测序，对测序结果进行分析，然后再做合成，再做进一步的鉴定，这步恰恰是我们目前的难点所在。
为什么说这一步是难点呢？因为我刚才说到了，前面的筛选过程，对我们实验室来说通常一个人需要1~2周的时间，而后面这个阶段，从测序、分析、挑选系列到合成，再到后面的鉴定要重复验证，而这个过程是非常的漫长，我们甚至需要两个月或三个月的时间才能够完成，而且后期的成本其实是高于前期成本的。
而且针对不同靶标这一部分的检测手段，差异性比较大。筛选时，筛选不同的小分子，我可以用类似的方法去筛选，但是我要去做亲和力检测时，很多时候不同的小分子、不同的靶标，需要用不同的方法，这也决定了后面整个实验的一个难度。
有很多人觉得后期的鉴定不就是一个例行的检测吗，例行的实验验证吗？为什么我们会觉得难呢？这边还有一个问题，我们在前面的筛选的时候，我们从10到15次方的文库得到很少的一些序列，比如说几万条这样一个文库，但是我们在做鉴定的时候，我们往往只能去合成及少量的序列，几条十几条或几十条这样的序列去做后期的验证。如果鉴定更多序列，成本很高，时间投入也很大。我们通过大量的高通量测序和无数个验证实验，发现那些高亲和力的序列，未必是那些富集率很高的序列。相反，那些富集程度很高的序列，往往并不见得是亲和力最高的，甚至它们根本没有亲和力。所以这给我们带来一个困扰，那就是我们到底该挑选哪些序列去做合成和验证呢？如果说我们仅仅是挑选那些富集程度高的话，我们极有可能会错过那些真正有价值的序列。
怎么能保证你不会错过有价值的适配体呢？那就是在你不了解的情况下，要尽可能多去合成一些序列。那么每多合成一条都会增加成本，而每多检测一个都会增加你后期实验的难度。所以这一步对我们来说是一个瓶颈，我们实验室目前的研究方向，在方法这一块主要是提升后续鉴定的通量，譬如通过单分子的方法，通过高超的测试方法，通过芯片的方法，通过流式的方法等等这一系列技术，这是我们目前关注的重点。
上面说道，我们实验室的前面做的比较快，后面是一个瓶颈，那是不是意味着我们现在所有的都能够筛选成功了呢？其实不是，我们实验室的筛选成功率尽管是相对比较高的，但是我们依然会面临很多失败的情况。这也是SELEX的难点所在。它难在什么地方，我想再做一点分析。
再回到刚开始我说的，为什么这些简单的分子生物学实验我们会失败呢？这里面其实因为整个筛选实验是一个长周期的实验，我们可能要筛选几周或者更长的时间。大家可以想象一下，当你去做一个实验，如果说你需要做很长时间，而中途你又不知道这个实验对还是不对，当你做了几周或者几个月之后，你发现你的实验失败了，那种感觉是非常令人沮丧的。而这个时候你怎么去分析原因呢？因为步骤很多，时间跨度很长，你甚至记不清楚开始是怎么做实验的，你甚至没有记下来开始用什么样的条件，所以这个时候你尽管失败了，你根本不知道失败在什么地方，你即便再去重复一次，你可能也很难找到失败的原因。所以，SELEX实验难的一个重要原因是它缺少一些中间过程的监测点，无法及时给你提供反馈，无法及时告诉你中间的实验步骤是对还是错。
你可能会想到，我筛选的时候去测亲和力不就可以了么？其实对于多数靶标的筛选来说，在早期的时候，在前面几轮的时候，你是根本看不到有任何亲和力的，那么这个时候你怎么去判断正确还是错误，是该继续还是该放弃呢？
这还没有一个非常好的方法，所以在过去的六七年的时间里，我们花了很大时间去建立这样一个监测指标，去判断筛选是否在朝正确道路上走。这就涉及到整个筛选进程的监测。
说到筛选进程监测这一块，其实也有不同的方法。基本的原理是两个，第一个就是检测结合的情况，是看看有没有亲和力，有没有比前一轮结合的更多一些，那这是一个非常重要的标准，这种方法的话也是比较重要的一个方法，也是比较客观的，但是有时候你还是找不到一个合适的方法，帮你去衡量它结合量多还是少。在这一部分我们一般使用结合比的方法来进行定量，就是每一轮我去观观测它结合比有没有提升。
另外一种监测筛选进程的方法是看每一轮获得文库的库容变化，就是随着筛选的进行库容是否在下降，按照一般的规律来说，随着筛选进程进行，你的库容会逐步降低，这也是一个判断指标。但是库容仅仅是一个参考指标，它不是一个筛选成败的金标准。也就是说你的库容如果在降低，说明正在富集，但它并不代表你的筛选是成功的。但是这种方法也有它的一个好处，就是可以帮助你判断筛选的终点。就是当你筛选几轮之后，你发现库容很小的时候，如果你依然检测不到亲和力，那么你就可以认为筛选是失败的。因为，当库容很低的时候，文库中的分子数非常少，如果还没有检测到有亲和力，极有可能在早期，高亲和力的分子被丢掉了。这个时候，你就可以果断放弃了。所以这种监测库容的方法，尽管它不能够明确告诉你，你的筛选是否正确，但是它可以帮助你去判断你是否该放弃还是该继续，所以这也是一个非常重要的指标，这个方法的话大家可以参考我们发表的文章（参考这里：https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2017/an/c7an01131h ）。
筛选真正难在什么地方呢？就是核酸适配体有很多机理性的问题没有搞清楚，举一个简单例子就是核酸适配体，它的结构会受它所处的溶液环境，pH值，离子强度，阳离子的种类等因素影响。这些都会影响到折叠，而折叠就会影响它的功能。但是这些因素怎么去影响的呢？到底会有什么样的影响？然后这些因素又会对结构带来什么样的变化，以及这种结构与功能的关系，这些方面研究还非常的欠缺，所以就导致我们在使用一个适配体的时候，当我们发现它的功能不能重现的时候，也许是它的结构折叠发生变化，但我们目前缺少非常灵敏的监测结构变化的手段。如果对于单个适配体来说，我们可以准备大量的样品，用CD来检测，也可以去结晶，或者做核磁。但是所有这些方法都是极其低效极其昂贵的。所以，如果从基础研究层面来说，核酸适配体筛选的难点来自于基础研究的欠缺，特别是结构与功能研究的欠缺，在往底层说，其实就是核酸结构研究手段的欠缺。
为什么这么说？我们可以看一下目前核酸结构的主要研究手段。主要X-ray晶体衍射，以及NMR，但是这两个手段目前都不太适合于研究核酸。譬如核磁，它只能研究比较小片段的核酸序列，目前的话通常在30个以下会比较容易研究，那X-ray的话, 如果核酸适配体不能够长出晶体的话，也很难去研究。核酸适配体结构具有一定的柔性，所以有些人会把它和它的靶标放在一起共结晶得到这个复合物晶体，然后再去解决结构，但是多数的核酸适配体很难去长出晶体来，这也导致绝大部分的核酸适配体没有结构信息，导致我们不知道它的结构是什么样的。目前另一个非常火热的研究大分子结构的手段，冷冻电镜技术。冷冻电镜目前它很难去做小分子的结构，而且核酸适配体它的结构是一个柔性的，所以即便是成像了也很难去做叠加分析，加上核酸适配体本身比较小，冷冻电镜也是无能为力的。所以目前三大主流研究结构的技术晶体衍射，核磁和冷冻电镜对核酸适配体都无能为力。正式因为这种底层的基础研究数据缺乏，导致我们对核酸适配体结构功能关系缺少深入的理解。当我们碰到问题的时候，我们很难从底层，从结构功能角度去做一些分析。这就是说真正基础性的研究欠缺，导致我们在筛选层面，以及在应用层面碰到很多问题的时候，我们不知道如何去解释。这方面，我们几乎无能为力，只能期待核酸结构研究技术早日获得突破。
核酸适配体技术从1990年建立以来经历了近30年，那么这30年过程当中，其实筛选方法一直在进步，但也没有突破性的进展，核酸适配体也没有像人们想象那样获得广泛的发展，整个产业依然是比较小众，那这个背后原因，其实真正的难点在于基础研究没有获得突破，导致筛选技术瓶颈没有突破。筛选出来的东西少了，能走到产业化应用阶段的就更少了。
我相信在未来的三五年，筛选技术一定会取得突破性的进展。筛选的适配体多了，有价值的也会多，能走到产业化阶段的也会多起来。产业生态才会慢慢建立，形成一个生态圈。我相信在未来3到5年之内，筛选技术筛选方法还会有很多新的技术建立起来，特别是高通量鉴定的方法，快速鉴定的方法。
其实筛选方法研究和结构功能研究，是相辅相成的。筛选到大量的适配体，有助于我们研究结构与功能，也可以让我们更好地理解结构与功能的关系。结构功能关系搞清楚了，可以更好地指导我们改进筛选方法。所以，这两者其实是一个相互促进的关系。
对于我们来说，我们比较擅长的还是做筛选技术研究，我们无法去做结构研究，所以我们会尽量提升筛选的成功率，建立高效的筛选方法，尽可能获得更多的优质的适配体。
简单总结一下，就是核酸适配体筛选困难，虽然它本身的技术并不复杂，难点是在于我们对整个核酸适配体缺少一些了解，而对它缺少了解，原因是基础研究的缺乏，基础研究的缺乏又源自研究手段的欠缺。
总之，筛选，依然很难。
