免疫PCR试验方法全解析
*、材料与方法
【生物素标记特异性抗体的制备】
免疫球蛋白的Fc片段上有糖基存在，因而可用能与糖基结合的Biotin-hydrazide作生物素标记。
① 将纯化的抗体(IgM或IgG，0.1~1.0ml)在标记缓冲液(0.1Mol/L NaAc，pH值5.5，0.1Mol/L NaCl)中4℃透析放置一个晚上。
② 吸取0.5ml至微量离心管中，加过碘酸钠溶液至终浓度为10mMol/L，置冰浴上于暗处孵育30min，使抗体分子上的糖基氧化。
③ 将氧化的抗体过PBS平衡的Sephadex G25 PD-10预装柱，使之与过碘酸钠分开。收集蛋白峰。
④ 向抗体管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至终浓度5mMol/L，置混摇器上室温孵育1h。
⑤ 用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25预装柱，将生物素标记的抗体分子过柱与游离的生物素分开。收集蛋白峰，保存-20℃。
【生物素标记DNA段的制备】
作为将与抗体偶联的报告DNA段，应确保在待测抗原来源的机体DNA中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告DNA去检测人源的标本。DNA段大小为300~500bp，生物素标记可采用PCR方法，根据报告DNA的核苷酸序列合成一对引物，其中一个引物的5’端碱基上带有生物素标记。
在0.5mlPCR管中按表将下列试剂混合。
表PCR系统组成
·加水至100uL
·混匀后上面覆盖液体石蜡。
·95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增：94℃ 1min;55℃ 1min;72℃ 1min; 40个循环。zui后72℃延伸10min。
·加等量酚-抽提，然后加10ul 3Mol/L Kac，250uL无水乙醇，置-70℃30min。
·离心沉淀DNA段，用70%乙醇洗一次。
·将沉淀DNA干燥后溶于TE缓冲液中，保存在-20℃。
【制备抗体-亲和素-DNA复合物】
将生物素标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中，室温孵育30min，再加入两倍分子浓度的生物素标记的DNA段，继续孵育30min，zui后加入10倍分子浓度的生物素，将亲和素分子上的结合部位饱和。zui后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开，加入BSA达1mg/ml，分装后冻存于-20℃。
【免疫PCR】
① 按常规ELISA方法，用饱和缓冲液稀释抗原，加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中，4℃过一夜。
② 用PBS洗三次，然后每孔加200ul封闭液(PBS含10mg/ml BSA，1mg/ml鱼精DNA)，室温孵育30min。
③ 用TETBS(其配方：20mMol/L EDTA，0.02%NaN3)洗三次。
④ 将抗体-亲和素-DNA复合物稀释于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml鱼精DNA的TETBS中，每孔加50ul，室温孵育1h。
⑤ 用TETBS洗5次，然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。
⑥ 每管中加50ulPCR反应液，含有表成分：
·加水至50μL
·混匀后上面覆盖液体石蜡。
·95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增35个循环：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min。zui后72℃延伸10min。
·每管取5ul作琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后观察结果，如在PCR时加入了放射性核素标记，则可用X光片显影。
·亦可在凝胶电泳后做Southern-blot，用特异性探针杂交，进一步提高其特异性和敏感性。
第二、注意事项
1.本实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物
2.免疫PCR具有高敏感性。
因此，抗体和标记DNA的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉了，亦可在zui后通过增加PCR的循环次数得到弥补。
3.应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。
4.标记DNA序列完全是人为选定。
5.【免疫PCR试验方法】可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此，应用免疫PCR可在微观水平(单细胞)检测抗原，定量PCR产物可以估计某一标本中的抗原数量，在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。
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