与 rRNA, 5SRNA, 5.8 SRNA 和 tRNA 相比，大多数真核生物的 mRNA 在其 3' 端带有 poly(A) 尾巴。因此，mRNA 能用 oligo(dT)-纤维素亲和层析法从细胞总 RNA 中分离 (Edmonds et al. 1971; Aviv and Leder 1972)。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
| 实验方法原理 | 与 rRNA, 5SRNA, 5.8 SRNA 和 tRNA 相比，大多数真核生物的 mRNA 在其 3' 端带有 poly(A) 尾巴。因此，mRNA 能用 oligo(dT)-纤维素亲和层析法从细胞总 RNA 中分离 (Edmonds et al. 1971; Aviv and Leder 1972)。 |
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| 实验材料 | 总 RNA |
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| 试剂、试剂盒 | 装柱缓冲液洗脱缓冲液乙醇NaClNaOH乙酸钠 |
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| 仪器、耗材 | Sorvall SS-34 转子或相当的转子杯子巴氏滴管贮存 RNA 设备oligo (dT)-纤维素pH 试纸水浴 |
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| 实验步骤 | 一、材料
1. 缓冲液和溶液
2X 装柱缓冲液（40 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6)，1 rnmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.2% (m/V)月桂基肌氨酸钠）
洗脱缓冲液（10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，0.05% SDS）
乙醇
NaCl ( 5 mol/L), 无 RNA 酶
NaOH ( 10 mol/L)
乙酸钠（3 mol/L, pH 5.2)
2. 核苷酸和寡聚核苷酸
总 RNA
3. 离心机和转子
Sorvall SS-34 转子或相当的转子
4. 专用设备
测量 260 nm 吸光度的杯子
Dispocolumn ( Bio-Rad) 或塞以无菌玻璃毛的巴氏滴管
贮存 RNA 设备
oligo (dT)-纤维素
pH 试纸（pH 测试条，Sigma )
预设水浴至 65℃
二、方法
装柱与填柱
1. 取 oligo (dT) —纤维素 0.5~1.0 g, 用 0.1 mol/L NaOH 重悬。
2. 用 oligo (dT) —纤维素（0.5~1.0 ml 柱体积）灌注 DEPC 处理过的一次性柱子（或塞以无菌玻璃毛的巴氏滴管，300℃ 烘烤灭菌 4 h)。用 3 倍柱体积 DEPC 处理过的水洗涤柱子。
3. 用无菌的 1X 装柱缓冲液（用无菌的 DEPC 处理过的水稀释 2X 的贮存液）洗涤柱子，直到流出液的 pH 值 < 8.0。用 pH 试纸测试。
4. 用双蒸灭菌的水溶解 RNA，65℃，5 min 处理溶液。将溶液快速冷却到室温，并加入 1 倍体积的 2X 装柱缓冲液。
柱上 poly (A)+ 的恢复
5. 将 RNA 溶液加到柱上，并立即用无菌的管子收集流出液。当所有的 RNA 溶液进入柱子时，用 1 倍体积的 1X 装柱缓冲液洗柱，继续收集流出液。
6. 当所有的液体流出柱子后，65℃ 加热收集液 5 min, 重新加到柱子中。再次收集流出液。
7. 用 5~10 倍柱体积的 1X 的装柱缓冲液洗涤柱子，用无菌塑料管（如微量离心管）收集 1 ml 洗涤液
8. 按 1:20 比例稀释各部分收集液，用石英杯或处理过的异丁烯杯测量 260 nm 处的吸光值，以 1X 的装柱缓冲液作为空白对照。
9. 将包含大多数 OD260 物质的部分用 2.5 倍体积的乙醇沉淀。
从柱中洗脱 poly(A)+ RNA
10. 用 2~3 倍柱体积的无菌、无 RNA 酶的洗脱缓冲液从 oligo (dT)-纤维素柱上洗脱 poly (A)' RNA。收集相当于 1/2~1/3 柱体积的流出液。
11. 用石英杯或处理过的异丁烯杯测量各部分收集液在 260 nm 处的吸光值。混合包含洗脱 RNA 的部分。
RNA 的进一步纯化（可选）
经过一轮 oligo(dT)—纤维素柱的层析得到的物质通常会包含大约相同数量的多聚腺苷酸和不含多聚腺苷酸的 RNA, 可以按下面的步骤进一步纯化。
12. 为进一步纯化 poly(A)+RNA，65℃ 加热准备的 RNA 3 min, 然后迅速冷却到室温。用 5 mol/L NaCl 调整洗脱的 RNA 中的 NaCl 浓度至 0.5 mol/L，在同一个 oligo (dT) —纤维素柱上进行第二轮层析（重复步骤 3 和 5~11)。
13. 对于第二轮 oligo (dT) —纤维素柱层析洗脱下来的 poly (A)+ RNA, 加入 3 mol/L 的乙酸钠（pH 5.2) 至终浓度 0.3 mol/L。混合均匀。加入 2.5 倍体积冰冷的乙醇，混合，将该溶液置于冰上至少 30 min。
14. 在 10000 g（相当于 Sorvall SS-34 转子 9000 r/min), 4℃ 下离心 15 min。小心弃掉上清，用 70% 乙醇洗涤沉淀（通常是不可见的）。稍做离心，吸出上清，将敞口的管子倒置几分钟，使大部分剩余酒精蒸发。不要使沉淀干燥。
15. 重新将潮湿的 RNA 沉淀用小体积的无菌、DEPC 处理过的水溶解。用石英杯或处理过的异丁烯杯测量每一部分柱子收集液在 260 nm 处的吸光值。将含有 RNA 的部分混合。
16. 保存制备好的 poly（A）+ RNA。 |
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