基因表达快速分析新技术
实验概要
介绍了一种新的基因表达快速分析技术-MPSS 技术的基本原理、技术路线及其优点和应用。
实验原理
MPSS技术是利用限制性内切酶和荧光检测知识,发展出的一种辨认和测定细胞每一个cDNA 克隆片段末端16～20bp序列的方法,从而查明细胞内所有基因的表达情况。
MPSS 分析系统大体可划分为三大部分,如图1
所示:微球体阵列槽、反应液供排系统和荧光信号处理系统。其中微球体阵列槽主要功能是微球体从槽的一端进入,在槽内紧密排列形成微球体阵列;反应液供排系统主要功能是在连接、酶切、洗脱等过程中自动供排所需的反应液;荧光信号处理系统则主要负责荧光信号的收集和处理,该系统主要由弧光灯源、荧光显微镜、CCD
照相机、计算机及相应的数据处理的软件构成。
实验步骤
1. 首先将cDNA 模板体外“克隆”到直径5μm的微球体上。“克隆”的方法主要是利用人工设计长度不同的两类互补寡核苷酸,分别与cDNA 模板和微球体连接之后,再将cDNA 模板与微球体连接起来。为了能装载下细胞内所有的cDNA 模板(若以3～4×104 个基因计算),寡核苷酸的数量至少应该要比模板的量多100 倍以上,为此Brenner 等设计了1167×107 个片段长32mer 的寡核苷酸,这样足可以保证生物体所有不同的cDNA 模板都能与不同的寡核苷酸相连接,而且每一个的微球体上也可承载104～105 个相同的cDNA 拷贝。
2. 用DpnII 酶切处理微球体上的cDNA 模板,形成粘性末端。
3. 用含有II 型限制性内切酶Bbv1 识别位点的不同寡核苷酸接头与连接在微球体上的cDNA 模板相连接,另外每一种接头的3’端还带有一个荧光标记,可与荧光探针杂交,产生荧光信号,该信号可以反映出接头5’端与模板cDNA 杂交的不同位置上的碱基信息,从而获取模板cDNA 的序列信息。
4. 分别加入能产生红黄蓝绿杂交信号的四套荧光探针,进行杂交, 每次杂交完毕用洗脱液清洗微球体阵列,除去上一轮杂交的荧光探针。用显微拍照的方法记录荧光信号,并将四种信号的图像输入计算机储存。
5. 用II 型限制性酶Bbv1 进一步消化cDNA模板,Bbv1 能在距识别位点约13 个碱基的位置切割cDNA 双链,并在cDNA 模板上产生下4 个碱基末端。
6. 洗脱除去寡核苷酸接头,经过Bbv1 酶切后的cDNA 模板,进入下一轮分析。重复3～5的步骤4～5 次后,分析所得到的16～20 张荧光显微照片,就可以读出微球体阵列中每一个微球体上长度为16～20bp 的cDNA 模板序列。
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